黑種草子提取物調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及血管新生作用

王紅蕊，閆 蓉，高 俐，李正濤，楊 淬,，杜冠華

(1.云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

黑種草子提取物調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及血管新生作用

王紅蕊1，閆 蓉2，高 俐1，李正濤1，楊 淬1,2，杜冠華2

(1.云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

目的研究民族藥黑種草子提取物調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和血管新生的作用及其機(jī)制。方法將不同濃度的黑種草子提取物作用于原代培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(rat aortic endothelial cells, RAECs)，觀察其對(duì)RAECs體外成管、增殖和遷移的作用，同時(shí)以Western blot法檢測(cè)RAECs中TGF-β1、Smad3、PDGFR、Cx43的表達(dá)水平，以及Akt和內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)蛋白磷酸化水平，并檢測(cè)RAECs產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide, NO)的情況。結(jié)果黑種草子提取物可濃度依賴性地促進(jìn)RAECs的體外成管、增殖和遷移，明顯上調(diào)RAECs中TGF-β1、Smad3、PDGFR以及Cx43蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Akt和eNOS的磷酸化水平，并可明顯促進(jìn)RAECs中 NO的生成。結(jié)論民族藥黑種草子提取物可能通過(guò)激活A(yù)kt-eNOS通路，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，通過(guò)激活TGF-β1-Smad3通路促進(jìn)體外血管新生，并可提高PDGFR和Cx43蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)新生血管的成熟與穩(wěn)定。民族藥黑種草子可能成為缺血性疾病的新型治療藥物。

民族藥；黑種草子；血管新生；內(nèi)皮細(xì)胞；缺血性疾病；內(nèi)皮功能

血管新生是血管中的內(nèi)皮細(xì)胞以出芽的模式形成新血管的過(guò)程[1]。血管新生是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜病理生理過(guò)程，在機(jī)體的多種病理過(guò)程(如創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、慢性炎癥、缺血性疾病、惡性腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等)，特別是在組織修復(fù)和再生的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。血管生成過(guò)程涉及多種復(fù)雜的至關(guān)重要的細(xì)胞行為，如內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，細(xì)胞外基質(zhì)的降解蛋白質(zhì)等[4]。尋找具有調(diào)節(jié)血管新生作用的藥物[5]，對(duì)于多種疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。

黑種草子(SemenNigellae)為毛茛科植物腺毛黑種草(NigellalanduliferaFrevnetSint.)的干燥成熟種子，廣泛生長(zhǎng)在地中海南部、中東、東歐和亞洲西部地區(qū)。在我國(guó)主要產(chǎn)于新疆及云南傣族聚居區(qū)。它可以在食物中當(dāng)作香料使用，同時(shí)也被作為藥物在許多國(guó)家使用，主要用于哮喘、咳嗽、支氣管炎、頭痛、風(fēng)濕等疾病的治療。近年來(lái)研究表明，黑種草子含有的化學(xué)成分包括生物堿、黃酮類、酚類、皂苷類以及揮發(fā)油、蛋白質(zhì)、油脂類化合物[6]，其提取物的藥理作用主要表現(xiàn)為抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗血小板聚集、降脂、降糖、保肝等多種活性。但黑種草子調(diào)節(jié)血管新生的功能和機(jī)制尚未見報(bào)道。本文采用體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，研究了黑種草子提取物調(diào)節(jié)血管新生的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1動(dòng)物SD大鼠，♂，體質(zhì)量(180±20)g，約16周齡，購(gòu)自云南省昆明醫(yī)科大學(xué)。

1.2藥物與試劑干燥黑種草子，購(gòu)自云南昆明市場(chǎng)；無(wú)水乙醇購(gòu)自拓源生物有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)：SH30809.01)購(gòu)自Hyclone；優(yōu)級(jí)胎牛血清(批號(hào)：FSP500)購(gòu)自S.America；EDTA-胰蛋白酶消化液(批號(hào)：CB000-C022)購(gòu)自ExCell Bio；青-鏈霉素(批號(hào)：SL6040)購(gòu)自Solarbio；組織蛋白抽提試劑盒(批號(hào)：CW0891M)、HRP標(biāo)記山羊抗大鼠IgG(H+L)(批號(hào)：CW0104)、HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG(H+L)(批號(hào)：CW0103S)、ECL化學(xué)發(fā)光顯色劑(批號(hào)：CW0049M)，均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司; Anti-eNOS 抗體(批號(hào)：TA314271)、Anti-p-eNOS(Ser-1177)抗體(批號(hào)：TA333266)，購(gòu)自O(shè)riGene； Anti-TGF-β1抗體(批號(hào)：ab125310)、Anti-Akt抗體(批號(hào)：C67E7)、Anti-p-Akt(Ser-473)抗體(批號(hào)：AA329-1)，均購(gòu)自Abcam；Anti-Smad3(批號(hào)：#9523)、Anti-Cx43(批號(hào)：TA311737)、Anti-PDGFR(批號(hào)：#3169)抗體，均購(gòu)自Cell Signaling公司；Matrigel(批號(hào)：356234)購(gòu)自美國(guó)BD公司；臺(tái)盼藍(lán)(批號(hào)：T8070)購(gòu)自索萊寶；NO試劑盒(批號(hào)：A012)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100S，Ankeyq)，高速離心機(jī)(5417R， Eppendrof)，超聲波清洗器(AS10200A，天津奧特賽恩斯)，CO2培養(yǎng)箱(3517-2, SHELLAB)，蛋白印跡體系(Bio-Rad)，化學(xué)發(fā)光成像儀(ChemiDOCXS+，Bio-Rad)，E-Plate L8 細(xì)胞培養(yǎng)板(ACEA)，xCELLigence RTCA S16細(xì)胞分析儀(ACEA)，酶標(biāo)儀(MultiskanGo，Thermo)，HW-1000超級(jí)恒溫水浴(成都泰盟科技有限公司)。

2 方法

2.1黑種草子提取物的制備稱取200 g黑種草子于2 000 mL圓底燒瓶中，加入 60%的乙醇1 200 mL，浸泡4～6 h后，約80℃加熱回流提取4 h，濾出提取液，反復(fù)3～5次，合并回收溶劑，冷卻后，超聲震蕩5～10 min，室溫12 000 r·min-1離心20 min后，過(guò)濾得到濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，制得浸膏，備用。

2.2原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(rataorticendothelialcells,RAECs) 用10%的水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射SD大鼠，待麻醉后，在無(wú)菌條件下開胸取胸主動(dòng)脈，將大鼠胸主動(dòng)脈上的脂肪、結(jié)締組織剔除干凈，隨后用剪刀剪成若干片,每片約3 mm×3 mm的大小，內(nèi)皮面向下輕輕貼入25 cm培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h后，再向培養(yǎng)瓶中緩慢加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1%青-鏈霉素(penicillin-streptomycin, PS)的RPMI 1640培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用0.25%胰酶消化后傳代用于實(shí)驗(yàn)。

2.3內(nèi)皮細(xì)胞體外成管取 4℃冰箱過(guò)夜保存的基質(zhì)(Matrigel)，以每孔50 μL鋪到96孔板中，于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置30 min使其凝固。加入100 μL血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液(4×107·L-1)，然后加入藥物，使其終濃度為500、100、20 mg·L-1，混勻，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察微管形成情況。每孔選擇上、下、左、右及中間共5個(gè)不同部位，計(jì)算微管形成數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.4細(xì)胞增殖向E-Plate L8細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入50 μL培養(yǎng)基，放入細(xì)胞分子儀檢測(cè)臺(tái)上(置于培養(yǎng)箱中)開始檢測(cè)基線。 然后， 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞并調(diào)制細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸液加入E-Plate檢測(cè)板中，每孔50 μL約為104個(gè)細(xì)胞。將E-Plate L8細(xì)胞培養(yǎng)板置于超凈臺(tái)內(nèi)，室溫放置30 min后放到檢測(cè)臺(tái)上，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞增殖檢測(cè)。等細(xì)胞完全貼壁后，再向E-Plate檢測(cè)板中分別加入等體積的含有不同濃度黑種草子提取物的培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞增殖檢測(cè)。

Fig 1 Effects of Semen Nigellae. extract on the tube formation(±s, n=3)

A:Tube formations were detected. VEGF(10 μg·L-1) was used as the positive control;B: The area covered by the tube formation network was quantified.*P<0.05vscontrol group;C:Proliferation of RAECs in the presence or absence of the extract ofSemenNigellae.

A:The migration of RAECs was determined by using a Transwell system. VEGF(10 μg·L-1) was used as the positive control;B:Numbers of the migrating RAECs.*P<0.05vscontrol group

2.5Transwell實(shí)驗(yàn)Transwell板中加入無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中平衡1 h，上室加入100 μL含有不同濃度的黑種草子提取物的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基RAECs細(xì)胞懸液，下室加入含有0.6 mL 10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基刺激遷移，置于5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，然后棄去培養(yǎng)液，用90%乙醇固定30 min，0.4%臺(tái)盼藍(lán)常溫染色10 min后，顯微鏡下觀察拍照。計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.6免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Westernblot) 按照RIPA蛋白質(zhì)抽提試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，以上樣緩沖液與蛋白樣品4 ∶1的比例稀釋混合后，120℃加熱3 min，離心后上樣，電泳后，200 V、400 mA轉(zhuǎn)膜2.5 h，經(jīng)封閉和洗膜后，加入用TBST稀釋的一抗，4℃搖晃孵育過(guò)夜。再用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗，常溫?fù)u晃孵育結(jié)合2～4 h后，在化學(xué)發(fā)光成像儀下顯色。

2.7NO的測(cè)定按照NO測(cè)定試劑盒使用方法，測(cè)定各組樣品的吸光度。根據(jù)下式計(jì)算NO含量：NO含量/μmol·L-1=(測(cè)定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值) ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(100 μmol·L-1)×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

Fig 3 Extract of Semen Nigellae. enhenced Akt and eNOScontents and levels of their phosphorylation(±s,n=3)

A,C:RAECs were incubated with the extractofSemenNigellae(500, 100, 20 mg·L-1) for 15 min. VEGF(10 μg·L-1) was used as the positive control. Levels of phosphorylated and total Akt and eNOS;B: Average densitometric quantification showed the ratio of phosphorylated Akt to total Akt protein levels;D: Average densitometric quantification showed the ratio of phosphorylated eNOS to total eNOS protein levels.*P<0.05vscontrol group

Fig 4 Extract of Semen Nigellae increased levels oftotal TGF-β1 and Smad3(±s,n=3)

A,C:RAECs were pretreated with the extract ofSemenNigellae(20, 100, 500 mg·L-1) for 24 h. VEGF(10 μg·L-1) was used as the positive control. The levels of total TGF-β1 and Smad3;B,D:Average densitometric quantification of TGF-β1 and Smad3 proteins levels in different concentrations. β-actin served as a loading control.*P<0.05vscontrol group

3 結(jié)果

3.1黑種草子提取物促體外成管和增殖作用不同濃度的黑種草子提取物作用于RAECs 3.5 h后，可濃度依賴性地促進(jìn)RAECs體外成管；同樣，也可促進(jìn)RAECs的增殖(Fig 1)。

3.2黑種草子提取物對(duì)細(xì)胞遷移的影響不同濃度的黑種草子提取物作用于RAECs后，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色10 min后，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。Fig 2結(jié)果顯示，黑種草子提取物能夠明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。

Fig 5 Extract of Semen Nigellae increased levels oftotal PDGFR and Cx43(±s,n=3)

A, C:RAECs were pretreated with the extract ofSemenNigellae(20, 100, 500 mg·L-1) for 24 h. VEGF(10 μg·L-1) was used as the positive control. The levels of total PDGFR and Cx43;B, D:Average densitometric quantification of PDGFR and Cx43 protein levels in different concentrations. β-actin served as a loading control.*P<0.05vscontrol group

3.3黑種草子提取物對(duì)細(xì)胞TGF-β1、Smad3、PDGFR、Cx43以及磷酸化Akt和eNOS表達(dá)的影響提取內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白后，Western blot法檢測(cè)RAECs中TGF-β1、Smad3、PDGFR、Cx43蛋白表達(dá)水平，以及 Akt和內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)磷酸化水平。Fig 3、4、5結(jié)果顯示，黑種草子提取物可明顯上調(diào)RAECs中TGF-β1、Smad3、PDGFR、Cx43蛋白的表達(dá)，并可明顯促進(jìn)Akt和eNOS的磷酸化水平。

3.4黑種草子提取物對(duì)NO生成的影響按照NO測(cè)定試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定各組樣品的吸光度，根據(jù)公式計(jì)算NO的含量。結(jié)果顯示，黑種草子提取物可明顯促進(jìn)RAECs中 NO的生成(Fig 6)。

Fig 6 Effect of extract of Semen Nigellae onproduction of NO from RAECs(±s,n=3)

VEGF(10 μg·L-1) was used as the positive control.*P<0.05vscontrol group

4 討論

心腦血管疾病是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類生命健康的“第一殺手”。 肢體缺血性損傷、缺血性心肌梗死等缺血性疾病，已成為心腦血管疾病中一組嚴(yán)重危害人類生存質(zhì)量的臨床病癥[7-8]。臨床現(xiàn)階段通過(guò)常規(guī)手術(shù)和藥物治療后[9]，這一類缺血性疾病急性期的死亡率已有所下降，但是其所帶來(lái)的如出血傾向、加重心衰等一系列藥物副作用又給患者帶來(lái)極大的困擾。近年來(lái)，隨著治療性血管新生觀念的提出，促進(jìn)血管新生已成為治療缺血性疾病的研究熱點(diǎn)[10]。血管新生對(duì)于腫瘤形成和轉(zhuǎn)移、心血管以及免疫等系統(tǒng)疾病的防治極為重要，并存在復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。

黑種草子為我國(guó)傳統(tǒng)民族藥，具有多種保健及治療功能。前期研究證明，黑種草子含有多種可能調(diào)節(jié)血管新生的活性化學(xué)成分。為了對(duì)黑種草子調(diào)控血管新生的作用進(jìn)行探討，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在體外原代培養(yǎng)RAECs，觀察黑種草子提取物對(duì)RAECs形態(tài)結(jié)構(gòu)、增殖及體外成管等的影響。同時(shí)，檢測(cè)黑種草子提取物對(duì)血管新生相關(guān)病理生理過(guò)程涉及的分子通路的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黑種草子提取物可能通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Akt-eNOS通路，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，并可能激活TGF-β1-Smad3通路，促進(jìn)體外血管新生，同時(shí)通過(guò)提高PDGFR和Cx43蛋白的表達(dá)，促進(jìn)新生血管的成熟與穩(wěn)定。民族藥黑種草子可能成為缺血性疾病潛在的新型治療藥物，存在潛在的開發(fā)價(jià)值。

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RegulatingeffectsofSemenNigellaeextractonvascularendothelialcellsandangiogenesis

WANG Hong-rui1, YAN Rong2, GAO Li1, LI Zheng-tao1, YANG Cui1,2,DU Guan-hua2

(1.SchoolofEthnicMedicine,KeyLabofChemistryinEthnicMedicinalResources,StateEthnicAffairsCommission&MinistryofEducation,YunnanMinzuUniversity,Kunming650500,China;2.InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,DrugTargets&ScreeningCenter-theKeyLabofBeijing,Beijing100050,China)

AimTo investigate the effects ofSemenNigellaeextract on regulating endothelial functions and angiogenesis and the underlying mechanisms.MethodsAfter the extract ofSemenNigellaewas obtained, the extract was administered to the primarily cultured rat aortic endothelial cells(RAECs). Then, the tube formation, proliferation and migration ability of RAECs were examined, and the expression of angiogenesis-related signaling pathways proteins, such as transforming growth factor-beta1(TGF-β1), Smad3, platelet derived growth factor receptor(PDGFR), Cx43, Akt and endothelial nitric oxide synthase(eNOS),were detected via Western blot analysis. Meanwhile, production of nitric oxide(NO) from RAECs was also measured after treatment with the extract ofSemenNigellae.ResultsThe extract ofSemenNigellaesignificantly promoted the tube formation, proliferation and migration of RAECs in a dose-dependent manner. The protein expressions of TGF-β1, Smad3, PDGFR, Cx43, Akt and eNOS, as well as phosphorylation levels of Akt and eNOS, in RAECs were also markedly elevated by the administration ofSemenNigellae. In addition, the production of NO was notably enhanced by the extract ofSemenNigellae.ConclusionsThe extract ofSemenNigellaemay improve endothelial functions and angiogenesis by activating Akt-eNOS and TGF-β1-Smad3 pathway. Meanwhile, it may also promote the maturation and stability of nascent vasculatures by activating the PDGFR and Cx43-related signaling pathways. Hence,SemenNigellaemay be a new therapeutic drug for ischemic diseases.

ethnomedicines;SemenNigellae; angiogenesis; endothelial cells; ischemic diseases; endothelial function

A

1001-1978(2017)11-1611-07

R-332；R284.1；R322.12；R329.24；R364.3；R364.12；R543.022

時(shí)間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.052.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.026

2017-07-14,

2017-08-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81460553)；第57批博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(No 2015M570976)

王紅蕊(1990-)，女，碩士生，研究方向：民族藥活性篩選，E-mail:1060653577@qq.com； 杜冠華(1958-)，男，博士，研究員，研究方向：藥物活性篩選，通訊作者，E-mail: dugh@imm.ac.cn; 楊 淬(1975-)，男，博士，副教授，研究方向：民族藥活性篩選，通訊作者，E-mail: yangynni@163.com