延胡索酸堿提取物HPLC指紋圖譜及主成分分析

金力薇，趙靈佳，岳顯可，陳薇娜，錢 敏，楊海燕

延胡索酸堿提取物HPLC指紋圖譜及主成分分析

金力薇1，趙靈佳1，岳顯可2,3*，陳薇娜3，錢 敏2，楊海燕3

目的建立延胡索不同濃度酸堿提取物的HPLC指紋圖譜，并結合主成分分析法(PCA)評價不同提取物中的化學組分。方法用氨水、冰醋酸配制不同濃度酸堿水溶液，供試品加熱回流提取；采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.6%醋酸溶液(pH 5.0)為流動相，進行梯度洗脫，檢測波長280 nm，柱溫25 ℃，流速1 mL/min，構建HPLC指紋圖譜，用相似度軟件建立共有峰模式；應用SPSS 19.0分析軟件，以主要色譜峰峰面積為變量進行PCA分析。結果標定了延胡索不同酸堿提取物HPLC指紋圖譜的16個共有峰，并指認了其中6個共有峰，分別為原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿，各批次延胡索提取物的相似度在0.861～0.984；PCA結果表明，前3個主成分的累計貢獻率達到91.097%；選擇這3個因子對延胡索不同酸堿提取物進行綜合評價。結論HPLC指紋圖譜結合PCA可以快速、客觀地評價延胡索不同酸堿提取物的化學組分差異，并確定酸性溶液更適合延胡索生物堿類成分的提取。

延胡索；酸堿水溶液；指紋圖譜；主成分分析

0 引言

延胡索為罌粟殼植物延胡索Corydalisyanhusuo的干燥塊莖，別名元胡。在傳統醫學中有兩千多年的歷史，用于胸痹心痛、脘腹疼痛、腰痛、疝氣痛、痛經、閉經、產后瘀滯腹痛、跌打損傷等[1]，為中藥復方制劑中的常用藥，在神經系統[2]方面具有鎮痛[3]、鎮靜作用，在心血管系統方面有擴張冠脈血管[4]、抗心律失常[5]、保護心肌細胞作用[6]。延胡索多以其醋制品入藥，醋制能使難溶于水的生物堿與醋結合成為易溶于水的醋酸鹽，從而增加延胡索在水煎液中的總生物堿含量[7]。為進一步分析醋制對生物堿溶出的影響，排除炮制過程中熱作用帶來的影響，本研究以不同濃度酸堿水溶液為提取溶劑，對生延胡索片進行提取。同時利用HPLC指紋圖譜整體、宏觀的分析特點[8]，結合主成分分析法，對延胡索不同濃度酸堿提取物中化學組分進行分析。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 戴安UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；AL-204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；DK-98-ⅡA數顯電子恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥 新鮮延胡索藥材采自浙江金華東陽，新鮮切片，烘干，為生延胡索片；原阿片堿(批號：110853-201003，純度99.9%)、鹽酸巴馬汀(批號：110732-201108，純度86.2%)、鹽酸小檗堿(批號：110713-200910，純度97.9%)、延胡索乙素(批號：110726-201112，純度99.6%)購自中國食品藥品檢定研究院，去氫紫堇堿(批號：141207，純度98.12%)、紫堇堿(批號：150327，純度98.56%)購自成都普非德生物技術有限公司；氨水、冰醋酸、甲醇、磷酸、三乙胺為分析純，液相用甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 延胡索飲片的加工 新鮮延胡索采自浙江金華東陽，經浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司質檢科鑒定為罌粟科紫堇屬延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)的塊莖，新鮮切片，烘干為生延胡索飲片，備用。

2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；流動相：乙腈A-0.6%醋酸溶液(三乙胺調pH至5.0)B梯度洗脫(洗脫條件：0～50 min，15%～50%A；50～70 min，50%～80% A；70～75 min，80% A)；檢測波長：280 nm。色譜圖見圖1。

圖1 延胡索混合標準品HPLC色譜圖

2.3 對照品溶液的制備 稱取對照品原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿適量，于20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，溶解搖勻，制成含原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿濃度分別為286.71、252.14、256.01、244.32、306.27、228.17 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 稱取延胡索粉末(過三號篩)約0.5 g，于具塞三角錐形瓶中，精密加入水50 mL，稱重，冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷，再稱重，用水補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.5 精密度試驗 取同一份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，連續進樣6次，記錄色譜圖。以延胡索乙素為參照峰，計算共有模式圖譜的相似度分別為0.999、0.998、0.999、0.997、0.998、0.999、0.997，RSD為0.09%，表明精密性良好。

2.6 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進行檢測，記錄色譜圖。以延胡索乙素為參照峰，計算共有模式圖譜的相似度分別為0.996、0.999、0.997、0.998、0.999、0.998、0.999，RSD為0.12%，表明供試品溶液在0～10 h穩定性良好。

2.7 重現性試驗 取同一批次延胡索粉末6份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項下色譜條件進行測定記錄色譜圖。以延胡索乙素為參照峰，計算共有模式圖譜的相似度分別為0.997、0.995、0.996、0.999、0.995、0.996、0.998，RSD為0.15%，表明重現性良好。

2.8 延胡索酸堿提取物指紋圖譜建立

2.8.1 指紋圖譜的建立 稱取延胡索粉末約0.5 g，分別精密加入8.0%、4.0%、2.0%、1.0%、0.5%醋酸溶液，水，0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%氨水溶液各50 mL，按“2.4”項下方法繼續制備供試品溶液。按“2.2”項下色譜條件進行分析，得延胡索不同濃度酸堿提取物指紋圖譜。以AIA(*cdf)格式導入國家藥典委員會的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”，設定S1為參照圖譜，對保留時間的色譜峰進行多點校正和數據匹配，時間寬度為0.1 min，生成疊加圖，見圖2。

圖2 延胡索不同濃度酸堿提取物HPLC指紋圖譜疊加圖

2.8.2 共有峰標定 根據11批延胡索提取物指紋圖譜，利用中藥指紋圖譜相似度評價系統的數據匹配功能，標定16個共有指紋峰，見圖3。并指認3號峰為原阿片堿、9號峰為鹽酸巴馬汀、10號峰為鹽酸小檗堿、11號峰為去氫紫堇堿、12號峰為延胡索乙素、13號峰為紫堇堿，其中延胡索乙素為參照峰。延胡索不同濃度酸堿提取物共有峰相對保留時間與相對峰面積見表1。

圖3 延胡索不同濃度酸堿提取物HPLC共有峰模式圖

2.8.3 延胡索酸堿提取物指紋圖譜相似度評價 S1～S5為延胡索酸提取物，S6為延胡索水提取物，S7～S10為延胡索堿提取物，以共有峰模式圖譜為標準，進行整體相似度評價，結果顯示，各批次延胡索提取物的相似度在0.861～0.984，具體見表2。

2.9 主成分分析

2.9.1 特征值和方差貢獻率 應用SPSS 19.0軟件，以主成分特征值及貢獻率為依據，對延胡索不同濃度酸堿提取物進行主成分分析。由表3、圖4結果可知，其中第1、2、3主成分特征值分別為11.482、2.029、1.064，對應的貢獻率分別為71.765%、12.679%、6.652%，累計貢獻率為91.097%。

表1 各共有峰相對保留時間和相對峰面積統計表

表2 延胡索不同酸堿溶劑提取物相似度分析

表3 特征值和方差貢獻率

圖4 碎石圖

由表4可知，第1主成分主要反映原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿和1、4、5、6、7、8號峰的主要信息，第2主成分主要反映2、14、15、16號峰的信息。

以第1、第2、第3主成分為變量得到的三維投影圖載荷圖(圖4)，在投影圖中距離原點較遠的幾個點就是主成分1和2中權重較大的成分，對區分延胡索不同濃度酸堿提取物中起的作用較大。

2.9.2 延胡索酸堿提取物主成分得分、綜合得分及排名 以選擇的3個主成分貢獻率為權重系數，對延胡索不同濃度酸堿提取物進行綜合評價，計算主成分得分及綜合得分，見表5。其中酸濃度越大，其主成分1得分和綜合得分越高，而主成分1主要反映原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、紫堇堿和成分1、4、5、6、7、8等，說明酸提取物中生物堿類成分豐富且含量高；延胡索水提取物中化學組分及含量較酸提取物低；弱堿溶液抑制延胡索生物堿成分的溶出，然而，隨著堿濃度增大，延胡索生物堿溶出先增加后又下降。

表4 成分載荷矩陣

圖5 載荷圖

表5 延胡索不同溶劑提取物主成分得分、綜合得分及排名

3 討論

不同地區延胡索醋制方法和工藝有一定區別，如醋煮、醋蒸、醋炙，在這個炮制過程中，生物堿含量的變化，除了輔料帶來的影響，也不能排除熱作用對藥材組織的進一步破壞導致化學成分的溶出。本研究以生延胡索片為實驗材料，著重考察酸堿度對生物堿溶出的影響。通過HPLC指紋圖譜結合主成分分析法，對延胡索不同濃度酸堿提取物的化學組分進行分析，標定了16個共有峰，并指認了原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿，延胡索不同濃度酸堿提取物的相似度在0.861～0.984；主成分分析篩選了3個主成分，其中第1主成分貢獻率為71.765%，第2主成分貢獻率為12.679%，第3主成分貢獻率為6.652%，進而計算得到主成分得分和綜合得分。延胡索在醋酸溶液中的化學成分，特別是生物堿類成分的提取效果較好，也進一步驗證了經醋制后，延胡索生物堿與醋酸結合成易溶于水的醋酸鹽，從而更好地發揮藥效。

近年來，醫院、患者服用免煎配方顆粒的比重越來越大。然而，配方顆粒的投料必須是對應的飲片，比如醋延胡索顆粒必須是醋延胡索飲片經提取而得，類似的其他酒制、鹽制還很多。如果在提取過程中可以直接用生藥和相應的溶劑提取，則可以減少反復加工帶來的成分流失，也可以減少工序從而降低成本。本研究結果也為此設想提供初步的數據支持。

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[4] 俞靜,花寶金,樸炳奎.延胡索乙素對放射所致血管內皮細胞損傷的保護作用[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(8):584-587,601.

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HPLCfingerprintingandprincipalcomponentanalysisofRhizomacorydalisacidandalkaliextracts

JIN Li-wei1,ZHAO Ling-jia1,YUE Xian-ke2,3*,CHEN Wei-na3,QIAN Min2,YANG Hai-yan3

(1.the First People′s Hospital of Wenling,Wenling 317500,China;2.Zhejiang Chinese Medical University Medical Pieces,. LTD,Hangzhou 311401,China;3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

ObjectiveTo evaluate the contents of the chemical composition ofRhizomacorydalisacid and alkali extracts by HPLC fingerprint combined with principal component analysis (PCA).MethodsDifferent concentrations of acid and alkali aqueous solution were made up by ammonium hydroxide and acetic acid.Test sample solution was prepared by heating reflux.The chromatographic conditions were as follows:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),linear gradient elution of acetonitrile-0.6% acetate solution (pH 5.0).The detection wavelength was 280 nm.The column temperature was 25 ℃,flow rate 1 mL/min.The common mode of HPLC fingerprints ofRhizomacorydalisextracts was established with similarity evaluation software.SPSS 19.0 software was used for PCA analysis with the common peaks area as variables.ResultsThe common mode of the HPLC characteristic chromatographic profile was set up with 16 common peaks,and 6 of the common peaks was identified as protopine,palmatine hydrochloride,berberine hydrochloride,dehydrocorydaline,tetrahydropalmatine and corydaline.The similarity ofRhizomacorydalisextracts was 0.861～0.984.The PCA results showed that accumulative contribution of first three factors was up to 91.097%,which were chosen to comprehensively evaluate theRhizomacorydalisacid and alkali extracts.ConclusionHPLC combined with PCA can quickly and objectively evaluate the difference in chemical composition ofRhizomacorydalisacid and alkali extracts,and alkali aqueous solution is more suitable for extractingRhizomacorydalis.

Rhizomacorydalis;Acid and alkali aqueous solution;Fingerprint;Principal component analysis

2017-02-04

1.溫嶺市第一人民醫院，浙江 溫嶺 317500；2.浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司，杭州 311401；3.浙江中醫藥大學，杭州 310053

杭州市衛生科技計劃(一般)項目(2015A39)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201710021