液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片及其在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

鄧雪蕾，張?jiān)封?，袁浩鈞，劉松生，陳瑩瑩，郜晚蕾，周洪波，賈春平，趙建龍，卞曉軍,3,4*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所，上海 200050;3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306；4.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片及其在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

鄧雪蕾1，張?jiān)封?，袁浩鈞2，劉松生2，陳瑩瑩1，郜晚蕾2，周洪波2，賈春平2，趙建龍2，卞曉軍1,3,4*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所，上海 200050;3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306；4.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

設(shè)計(jì)與制作了一種基于聚二甲基硅氧烷-玻璃(PDMS-Glass)的多功能集成式液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ddPCR)芯片，該芯片由產(chǎn)生液滴的PDMS模塊和收集液滴的玻璃腔體模塊組成。PDMS模塊采用雙通道的T形結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，液滴產(chǎn)生速度快且通量高，在30 min內(nèi)可生成2×106個(gè)直徑約為20 μm的微液滴。玻璃腔體模塊中存儲(chǔ)的液滴在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無需轉(zhuǎn)移，可直接在原位PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)液滴均是一個(gè)微反應(yīng)器，經(jīng)過多次熱循環(huán)后，液滴仍能保持良好的穩(wěn)定性。選用副溶血性弧菌(VP)作為食源性致病菌的研究模型，考察了ddPCR芯片對(duì)其基因組DNA的絕對(duì)定量能力，結(jié)果表明，該ddPCR芯片對(duì)VP基因組DNA絕對(duì)定量的線性范圍寬，可跨越5個(gè)數(shù)量級(jí)(101～106copies/μL)，定量結(jié)果與DNA理論參考濃度間有很好的相關(guān)性。

數(shù)字PCR；液滴微流控芯片；致病菌；副溶血性弧菌

近年來，食物中毒或死亡事件在全球頻發(fā)，嚴(yán)重威脅著人們的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界每年的食源性疾病患者，約70%由致病微生物引起[1]。我國(guó)國(guó)家衛(wèi)計(jì)委關(guān)于2012至2015年各年度食物中毒事件情況的通報(bào)顯示：每年由致病微生物引起的食物中毒人數(shù)均最多，占全年食物中毒人數(shù)的50%以上[2-5]。在眾多的食源性致病微生物中，副溶血性弧菌(VP)是全世界范圍內(nèi)引起人類細(xì)菌性食源性疾病的首要病原體，在許多海產(chǎn)品和淡水產(chǎn)品中均可檢出，調(diào)查顯示VP在我國(guó)海產(chǎn)品和淡水產(chǎn)品中的污染率分別高達(dá)53.04%和38.78%[6-7]。VP食物中毒可導(dǎo)致傷口感染、敗血癥以及腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱等急性腸胃炎癥狀，重癥患者還會(huì)出現(xiàn)脫水、休克昏迷甚至死亡[8]。鑒于VP污染的高發(fā)性及其危害的嚴(yán)重性，開發(fā)靈敏、快速的檢測(cè)方法對(duì)于預(yù)防和控制食源性疾病的爆發(fā)具有重要的研究意義。

數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(dPCR)是繼實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)之后新興發(fā)展起來的第三代PCR技術(shù)，其原理是將樣品稀釋成幾萬甚至是幾百萬份，然后分配到獨(dú)立的反應(yīng)單元，每個(gè)反應(yīng)單元不包含或包含1個(gè)到多個(gè)拷貝的目標(biāo)DNA分子，各自進(jìn)行獨(dú)立的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后包含有目標(biāo)DNA分子的反應(yīng)單元發(fā)出熒光，而不含目標(biāo)DNA分子的反應(yīng)單元?jiǎng)t無熒光信號(hào)，最終根據(jù)陽性液滴占總液滴的比例以及泊松分布計(jì)算出起始目標(biāo)DNA的濃度，dPCR可對(duì)樣本中的目標(biāo)DNA分子進(jìn)行絕對(duì)定量[9-11]。在dPCR中，反應(yīng)單元的數(shù)量直接決定了對(duì)目標(biāo)DNA分子的檢測(cè)范圍，例如當(dāng)反應(yīng)單元的數(shù)量增加1個(gè)數(shù)量級(jí)，則可檢測(cè)的范圍也相應(yīng)地增加約1個(gè)數(shù)量級(jí)。當(dāng)樣本中的目標(biāo)DNA分子濃度較低或不同目標(biāo)DNA分子間的濃度差異較小時(shí)，增加反應(yīng)單元數(shù)量還有助于提高定量的精度，這類似于像素點(diǎn)數(shù)量與數(shù)字圖像分辨率間的關(guān)系[12]。與qPCR相比，dPCR定量不需要依賴參考基因建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且不易受PCR擴(kuò)增效率波動(dòng)的影響[9,13]。

隨著液滴微流控技術(shù)的高速發(fā)展，Bio-rad和Raindance公司分別推出了QX200TM和RainDrop PlusTM液滴數(shù)字PCR(ddPCR)系統(tǒng)，在拷貝數(shù)變異分析、基因表達(dá)、miRNA定量等方面取得了應(yīng)用進(jìn)展[14-16]。然而，這兩種ddPCR系統(tǒng)的價(jià)格比較昂貴，在操作過程中均需轉(zhuǎn)移液滴，步驟較多且易污染樣品，因此，發(fā)展一種集成化的簡(jiǎn)易式、經(jīng)濟(jì)型的ddPCR芯片十分重要。本課題組在前期研究中曾設(shè)計(jì)了一種基于礦物油飽和PDMS的ddPCR芯片，并成功應(yīng)用于致病菌DNA和肺癌相關(guān)的microRNA的定量分析[17-18]，該芯片在整個(gè)操作過程中無需轉(zhuǎn)移液滴且成本較低。不足之處在于：礦物油外滲增加了芯片制作與進(jìn)樣難度；液滴數(shù)量偏低(約2×104個(gè))，限制了ddPCR的檢測(cè)濃度范圍。為了改進(jìn)上述不足，本文設(shè)計(jì)了一種在芯片制備過程中無需摻入礦物油的PDMS-Glass芯片，該芯片由產(chǎn)生液滴的PDMS芯片和收集液滴的玻璃腔體緊密連接而成，制作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。PDMS芯片采用雙通道的T型結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)使得液滴產(chǎn)生速度快且通量高(約2×106個(gè))，采用玻璃腔體使整個(gè)操作過程無需轉(zhuǎn)移液滴，可在玻璃腔體中進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增，且擴(kuò)增后可在玻璃芯片上直接監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。選用VP作為致病菌模型，考察了PDMS-Glass芯片對(duì)VP基因組DNA 的定量分析性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

副溶血性弧菌(ATCC 33847，美國(guó)菌種保藏中心)；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)；PDMS單體和固化劑(SYLGARD@184 BASE and CURING AGENT，Dowcorning)；光敏膠(SU-8，Microchem)；Plus筆形雙面膠(日本)；礦物油(mineral oil，Sigma)；Triton X-100(Sigma Aldrich)；ABIL EM 90(Evonik)；Tween-20(生工生物工程股份有限公司)。

原位PCR儀(Eppendorf Mastercycler nexus flat)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500 fast，Thermofisher公司)；IX51倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

圖1 液滴產(chǎn)生模塊PDMS芯片的制作流程示意圖Fig.1 The schematic of fabrication process for PDMS chip where droplets were producedA：preparation of the patterned silicon mold by SU-8 soft lithography process(SU-8光刻工藝制備硅基模具)；B:fabrication of patterned PDMS chip by cast molding(模塑法制備PDMS芯片)

1.2.1PDMS-Glass芯片的設(shè)計(jì)與制作PDMS模塊的結(jié)構(gòu)采用autocad軟件設(shè)計(jì)得到。其制作分兩個(gè)步驟進(jìn)行：首先采用軟光刻技術(shù)制作圖形化的硅基模具，之后采用模塑法制作圖形化的PDMS芯片。硅基模具制作的流程如圖1A所示：(a)將 SU-8負(fù)性光刻膠旋涂在潔凈的硅片基底上，厚度約為30 μm，經(jīng)前烘(65 ℃，5 min，95 ℃，30 min)后緩慢降至室溫；(b)將打印有芯片結(jié)構(gòu)的掩模(mask)放置于涂有光刻膠的硅基底上，經(jīng)光刻機(jī)紫外曝光后進(jìn)行后烘(65 ℃，5 min，95 ℃，12 min)，緩慢降至室溫；(c)顯影固化后即可得到圖形化的硅片模具。PDMS芯片的制作流程如圖1B所示：(a)將制備好的硅基模具與10 μL全氟辛基三氯硅烷置于真空箱中保持3～6 h，(b)PDMS單體及固化劑按質(zhì)量比10∶1 混勻，經(jīng)真空脫氣后傾注在硅基模具上，置85 ℃恒溫箱中加熱固化，冷卻后將PDMS從硅片模具上剝離，在管道的樣品入口和油相入口處分別打孔；(c)將PDMS圖形面與載玻片通過等離子體鍵合即可得到液滴生成模塊的芯片結(jié)構(gòu)。對(duì)于玻璃腔體模塊的制作，則在PDMS模塊出口處，用厚度約30 μm的plus雙面膠將一塊2 cm×2 cm的蓋玻片與載玻片貼合以形成封閉的玻璃腔體模塊，體積約為12 μL。芯片使用前于105 ℃下加熱4 h以增大其內(nèi)表面的疏水性。

1.2.2VP基因組DNA的提取與濃度測(cè)定使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit,Tiagen)提取VP基因組DNA，提取步驟按操作說明執(zhí)行。應(yīng)用Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA Reagents and Kits(Invitrogen)對(duì)所提取的基因組DNA的濃度進(jìn)行初步定量，用無菌水將基因組DNA的濃度稀釋至107copies/μL，并于-20 ℃凍存，每次實(shí)驗(yàn)前新鮮稀釋。

1.2.3引物及探針使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針。VP的引物和TaqMan-MGB探針基于tlh基因序列設(shè)計(jì)得到。詳細(xì)信息見表1。

表1 副溶血性弧菌的tlh基因ddPCR的引物和探針序列Table 1 The primer and probe sequence for ddPCR based on tlh gene of VP

1.2.4ddPCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序樣品(水相)組成：1×Premix Ex Taq(Takara)，0.2 μmol/L上/下游引物，0.3 μmol/L探針，0.3%(體積分?jǐn)?shù)) Tween-20，1.0 μL不同濃度的細(xì)菌基因組DNA，無菌水。油相組成：含3% ABIL EM90和0.1% Triton X-100的礦物油。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s，再經(jīng)35個(gè)循環(huán)的變性(95 ℃，5 s)和退火延伸(58 ℃，30 s)。每個(gè)反應(yīng)平行做3次并設(shè)陰性對(duì)照(使用無菌蒸餾水代替目標(biāo)DNA)。

1.2.5ddPCR進(jìn)樣將PDMS-Glass芯片固定于顯微鏡載物臺(tái)，用多聚物管連接微量進(jìn)樣泵與芯片油相和樣品進(jìn)樣口。在油相進(jìn)樣口和樣品(水相)進(jìn)樣口處分別加入油相和PCR反應(yīng)液，調(diào)節(jié)進(jìn)樣壓力，控制液滴的尺寸和產(chǎn)生的速度。待液滴充滿玻璃反應(yīng)腔體后，使用摻有礦物油的PDMS(PDMS單體∶固化劑∶礦物油質(zhì)量比為10∶1∶2)對(duì)玻璃腔體的進(jìn)樣口和出樣口進(jìn)行封裝。

圖2 PDMS-玻璃芯片結(jié)構(gòu)Fig.2 The structure of the PDMS-Glass chip A：the schematic of the PDMS-Glass chip,which was composed of droplet generation module and droplet collection & PCR chamber module;B：autocad design for the droplet generation module；C：image of the enlarged T-shaped structure in Fig.1B；D：bright-field image of droplets generated by the PDMS-Glass chip：E：picture of the PDMS-Glass chip

2 結(jié)果與討論

2.1 PDMS-Glass芯片的設(shè)計(jì)與制作

圖2A是PDMS-玻璃芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，該芯片由兩大模塊組成：左側(cè)是用于生成液滴的PDMS模塊；右側(cè)是用于收集液滴和PCR擴(kuò)增的玻璃腔體模塊，兩大模塊緊密相連。圖2B是PDMS模塊的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)圖，主要包括一個(gè)油相進(jìn)樣口、一個(gè)樣品(水相)進(jìn)樣口以及雙通道T型接口。圖2C是T型接口的放大圖，樣品進(jìn)樣通道和油相進(jìn)樣通道的寬度分別為200 μm和100 μm，T型交匯處的通道寬度為20 μm，樣品流經(jīng)T型接口處受到油相的剪切力而被切割成一個(gè)個(gè)微液滴。在正向驅(qū)動(dòng)力和毛細(xì)作用下，微液滴順利進(jìn)入收集液滴的玻璃腔體模塊。圖2D是儲(chǔ)存在玻璃腔體模塊中液滴的明場(chǎng)照片，可以看出液滴尺寸較為均勻，直徑約為20 μm，體積約為4.19 pL。儲(chǔ)存在玻璃腔體中的液滴可直接在芯片上進(jìn)行原位擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后用熒光顯微鏡直接監(jiān)測(cè)玻璃腔體中液滴的熒光信號(hào)。

PDMS-Glass芯片集液滴的產(chǎn)生與收集、原位PCR擴(kuò)增與在芯片上進(jìn)行熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)等功能于一體，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程無需轉(zhuǎn)移液滴，避免了多次實(shí)驗(yàn)操作引起的液滴破碎和融合，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程，提高了分析效率。液滴產(chǎn)生模塊中，雙通道T型結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)使得生成的液滴速度快、通量高，可在30 min內(nèi)生成約2×106個(gè)尺寸均一的液滴，比商業(yè)化的QX200 ddPCR系統(tǒng)的液滴數(shù)量高2個(gè)數(shù)量級(jí)。高通量的液滴有助于提高ddPCR的檢測(cè)范圍，較快的液滴產(chǎn)生速度對(duì)于樣品中Taq酶活性的保持至關(guān)重要，是ddPCR成功擴(kuò)增的關(guān)鍵，也是實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。相比于本課題組前期設(shè)計(jì)的礦物油飽和的PDMS芯片，采用玻璃腔體收集液滴的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可以避免親油的PDMS對(duì)油包水液滴油相的吸收，保證了ddPCR擴(kuò)增的順利進(jìn)行，同時(shí)也有利于降低芯片的制作成本。

PDMS-Glass芯片制作也分兩個(gè)模塊分別進(jìn)行，其中關(guān)鍵環(huán)節(jié)是PDMS模塊中硅基模具的制備，即如何將圖2B所示的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到硅片上。圖1是PDMS模塊的制作流程示意圖。硅基模具的制作(圖1A)采用SU-8膠光刻工藝，SU-8光刻膠具有良好的力學(xué)性能和抗化學(xué)腐蝕性，經(jīng)濟(jì)耐用。首先制作圖形化的硅基模具：先在硅片上旋涂一層SU-8光刻膠，通過紫外曝光將掩膜(mask)上的圖形轉(zhuǎn)移至光刻膠上，再經(jīng)過顯影固化得到圖形化的硅基模具，一次制作可反復(fù)使用。采用模塑法制備得到圖形化的PDMS，借助等離子體將圖形化的PDMS與玻璃基底鍵合，即得到產(chǎn)生液滴的PDMS芯片(圖1B)。玻璃腔體模塊制作相對(duì)簡(jiǎn)單，通過雙面膠將蓋玻片與玻璃基底貼合即成。由兩個(gè)模塊組成的PDMS-Glass芯片實(shí)物圖如圖2E所示。

圖3 基于PDMS-Glass芯片的ddPCR工作流程Fig.3 Schematic showing the PDMS-Glass chip-based ddPCR workflowA.prepare PCR mixture and partition into droplets by PDMS-Glass chip,B.on-chip insitu PCR amplification and the reaction principle in droplet,C.on-chip monitoring the fluorescence of droplets using fluorescence microscope,D.calculate the target DNA concentration in the sample using the Poisson distribution principle(A.制備樣品，并通過PDMS-Glass芯片將樣品平均分配到多個(gè)液滴反應(yīng)單元中；B.在芯片上進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增及其原理圖；C.在芯片上原位讀取熒光信號(hào)；D.根據(jù)泊松分布原理計(jì)算樣本中目標(biāo)DNA的濃度)

圖4 基于PDMS-Glass芯片的ddPCR擴(kuò)增后一系列不同濃度VP基因組DNA(3×105～1×101 copies/μL)的熒光顯微鏡照片F(xiàn)ig.4 Fluorescent images after droplet digital PCR amplifica-tion using the PDMS-Glass chip with a series of different concentrations of VP DNA from 3×105 to 1×101 copies/μL H：no DNA template as negative control；the fluorescent images were captured from FAM channel of the microscope with the excitation and emission wavelength of (485±10) nm and (524±12) nm,respectively

2.2 基于PDMS-Glass芯片的ddPCR工作流程

基于PDMS-Glass芯片的ddPCR工作流程主要包括4個(gè)步驟(圖3)。第一步，制備樣品并通過PDMS-Glass芯片將樣品平均分配在多個(gè)液滴反應(yīng)單元中(圖3A)。第二步，在PDMS-Glass芯片上進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增反應(yīng)(圖3B)。芯片中的每個(gè)液滴都是一個(gè)微反應(yīng)器，液滴內(nèi)包含擴(kuò)增反應(yīng)所需的引物、探針、目標(biāo)DNA分子(有或者無)以及Taq酶等，存在目標(biāo)DNA分子的液滴為陽性液滴，沒有目標(biāo)DNA分子的則為陰性液滴，當(dāng)液滴通量足夠高時(shí)，每個(gè)液滴中含有0個(gè)或1個(gè)拷貝的目標(biāo)DNA分子。液滴內(nèi)擴(kuò)增反應(yīng)的原理如圖3B右圖所示，液滴微反應(yīng)器中包含3條短片段序列，分別為上、下游引物以及TaqMan探針，探針序列的一端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告染料分子，另一端標(biāo)記猝滅染料分子，對(duì)于陽性液滴，DNA首先變性，在Taq酶的作用下，引物退火延伸，Taq酶具有核酸外切酶的活性，可以“吃掉”結(jié)合到模板分子上的DNA片段，從而使FAM報(bào)告染料分子與猝滅染料分子分離，發(fā)出綠色熒光；而對(duì)于陰性液滴，F(xiàn)AM報(bào)告染料分子與猝滅染料分子間發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，擴(kuò)增結(jié)束后液滴無熒光信號(hào)。第三步，擴(kuò)增結(jié)束后，將芯片置于熒光顯微鏡下觀察儲(chǔ)存液滴的玻璃腔體區(qū)域液滴的熒光信號(hào)，并拍攝熒光照片，陽性液滴發(fā)出綠色熒光，陰性液滴則無熒光(圖3C)。第四步，使用自編的液滴自動(dòng)計(jì)數(shù)軟件統(tǒng)計(jì)出陽性液滴占總液滴的比值，并根據(jù)泊松分布原理計(jì)算出起始樣本中目標(biāo)DNA的濃度，當(dāng)樣品中目標(biāo)DNA的濃度較高時(shí)，液滴中可能會(huì)分配有大于1個(gè)拷貝的模板分子，通過泊松分布可對(duì)此進(jìn)行校準(zhǔn)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA分子的絕對(duì)定量。

2.3 基于PDMS-Glass芯片的ddPCR對(duì)VP的定量分析

ddPCR對(duì)目標(biāo)DNA定量的動(dòng)態(tài)范圍是評(píng)價(jià)該方法分析性能的重要指標(biāo)。選用VP作為研究對(duì)象，以VP基因組DNA為目標(biāo)基因，考察了基于PDMS-Glass芯片的ddPCR方法對(duì)DNA的定量分析性能。圖4是一系列不同濃度的VP基因組DNA經(jīng)ddPCR擴(kuò)增后的熒光照片，隨著VP基因組DNA濃度的降低，發(fā)出綠色熒光的陽性液滴的數(shù)量隨之減少(圖4A～G)，而對(duì)于沒有模板存在時(shí)的陰性對(duì)照(圖4H)，則全部液滴均無熒光信號(hào)。模板DNA分子在液滴中的分配遵循泊松分布(Poisson distribution)原理[19]，即每個(gè)液滴中包含k個(gè)DNA模板的概率為：

式中，λ為液滴中的平均模板數(shù)，只有當(dāng)λ<0.3時(shí)，才可確保大部分微單元含有數(shù)量不多于1的DNA模板。PDMS-Glass芯片可產(chǎn)生2×106個(gè)液滴，則理論上當(dāng)樣本中的模板數(shù)<6×105copies時(shí)，才可確保單個(gè)液滴中模板數(shù)≤1。在具體實(shí)驗(yàn)過程中(10 μL進(jìn)樣體積)，較低濃度(≤1 000 copies/μL)時(shí)，采用直接拍照計(jì)數(shù)陽性液滴數(shù)；對(duì)于高濃度樣本(>1 000 copies/μL)，則采用泊松公式[10,20]，根據(jù)陽性液滴數(shù)量占總液滴數(shù)量的比值對(duì)樣本濃度進(jìn)行校正：

其中，C為樣品中模板DNA 的濃度(copies/μL),n是液滴總數(shù)，p是陽性液滴數(shù),Vd是液滴的平均體積(pL)。

為了評(píng)估基于PDMS-Glass芯片的ddPCR方法對(duì)VP基因組DNA定量的準(zhǔn)確度，將ddPCR對(duì)一系列不同濃度VP基因組DNA的定量結(jié)果與其實(shí)際濃度進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，在較寬的濃度范圍內(nèi)(101～105copies/μL)，ddPCR方法測(cè)得的結(jié)果與參考值間有很好的相關(guān)度，線性的斜率接近于1，r2=0.999，這說明基于PDMS-Glass芯片的ddPCR方法對(duì)DNA的定量具有良好的準(zhǔn)確性。對(duì)于濃度較低(10～1 000 copies/μL)的目標(biāo)基因，ddPCR測(cè)量結(jié)果與參考值間仍存在較好的相關(guān)度，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996。不同于qPCR的相對(duì)定量，ddPCR可進(jìn)行絕對(duì)定量，無需依賴參考基因建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且不敏感于擴(kuò)增效率的變化。

3 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)與制作了一種基于PDMS-Glass的ddPCR芯片，該芯片集液滴的產(chǎn)生與收集、原位PCR擴(kuò)增及監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的功能于一體，整個(gè)過程無需轉(zhuǎn)移液滴，操作簡(jiǎn)便省時(shí)。芯片可在半小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生兩百萬個(gè)液滴，液滴的通量比商業(yè)化QX200 ddPCR系統(tǒng)高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。高通量的液滴經(jīng)過多次熱循環(huán)之后仍能保持良好的穩(wěn)定性，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)副溶血性弧菌基因組DNA的絕對(duì)定量，定量的線性范圍可跨越5個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)結(jié)果與理論參考濃度間具有良好的相關(guān)性。該方法在疾病診斷中的低拷貝數(shù)變異分析、食品安全中的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、環(huán)境中的致病微生物檢測(cè)等領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。為將基于PDMS-Glass芯片的ddPCR方法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，下一步將著力改進(jìn)PDMS-Glass芯片的進(jìn)樣方法，減少其對(duì)外部驅(qū)動(dòng)力的依賴。

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Fabrication of a Droplet Digital PCR Chip and Its Application in Pathogenic Bacteria Detection

DENG Xue-lei1,ZHANG Yuan-yi1,YUAN Hao-jun2,LIU Song-sheng2，CHEN Ying-ying1,GAO Wan-lei2,ZHOU Hong-bo2，JIA Chun-ping2，ZHAO Jian-long2,BIAN Xiao-jun1,3,4*

(1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306,China；2.State Key Laboratory of Transducer Technology,Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology,Chinese Academy of Science,Shanghai 200050,China；3.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation(Shanghai),Ministry of Agriculture,Shanghai 201306,China；4.Engineering Research Center of Food Thermal-processing Technology,College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

A polydimethylsiloxane-glass(PDMS-Glass) based droplet digital polymerase chain reaction(ddPCR) chip was designed and fabricated,which was integrated with multiple functions.The PDMS-Glass chip was composed of two modules,of which one was a PDMS module for droplet generation,and the other was a multi-functional glass chamber for droplet collection,insituddPCR reaction and on-chip fluorescence readout.The PDMS module has a T-shaped structure with two channels,where the aqueous phase with sample was cut into water-in-oil droplets by the oil phase.The droplets generated by the PDMS-Glass chip have the advantages of high-throughput and high-frequency.About two million uniform droplets with an average diameter of 20 μm could be produced within 30 minutes.The glass chamber was employed for droplets collection.No transfer of the droplets were required during the whole experiment.The droplets filled in the glass chamber were directly injected into theinsituPCR instrument for amplification reaction,where each droplet was a micro-reactor.The glass chamber provided the ddPCR with a good environment for ddPCR amplification,where the droplets kept stable after many times of thermal cycling.As one of the common pathogenic bacteria,VibrioParahemolyticus(VP) was selected to investigate the property of the PDMS-Glass based ddPCR chip on the aspect of absolute quantificaiton.The results showed that the ddPCR chip has a wide linear range of five-order-magnitude towards the genomic DNA ofVPfrom 101to 106copies/μL.Meanwhile,the detected results by ddPCR approach have a good relativity with the theoretical expected DNA concentration.

digital PCR；droplet microfluidic chip；pathogenic bacteria；VibrioParahemolyticus

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.004

O657；Q523

A

1004-4957(2017)10-1191-06

2017-06-21；

2017-07-19

國(guó)家自然科學(xué)基金(21405167,81472751,61271162)；上海晨光計(jì)劃(15CG54)；國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2017ZX10302201-005-006)

*

卞曉軍，博士，講師，研究方向：微流控生物分析化學(xué)技術(shù)，Tel:021-61900753，E-mail:xjbian@shou.edu.cn