殼聚糖/多壁碳納米管復合膜電化學手性識別色氨酸對映異構體

張亞會，徐 慧，劉 剛

(魯東大學 化學與材料科學學院,山東 煙臺 264025)

殼聚糖/多壁碳納米管復合膜電化學手性識別色氨酸對映異構體

張亞會，徐 慧*，劉 剛

(魯東大學 化學與材料科學學院,山東 煙臺 264025)

采用滴涂方式將羧酸化多壁碳納米管(f-MWCNTs)修飾于玻碳電極(GCE)表面成膜，然后恒電位法在上述修飾電極表面電沉積殼聚糖(CS)膜，形成CS和f-MWCNTs復合膜修飾電極(CS/f-MWCNTs/GCE)，并用于色氨酸(Trp)對映異構體的手性識別。采用掃描電子顯微鏡(SEM)表征了修飾電極表面形貌的差異，電化學阻抗(EIS)和循環伏安法(CV)研究修飾電極的電化學行為差異。差分脈沖伏安法(DPV)用于區別色氨酸(Trp)對映異構體，分離系數可達2.38。研究發現該修飾電極對L-Trp的DPV響應信號強于D-Trp,檢測的線性范圍為8.0×10-6～4.0×10-3mol/L，檢出限(S/N=3)為5.0×10-6mol/L。該方法簡單、經濟、快速，對發展其它手性化合物的檢測方法提供了參考。

殼聚糖；色氨酸；手性識別；電化學方法

手性是指物質本身不能與其鏡像重合的特性，是大自然和生命領域的基本屬性，手性廣泛存在于生命、藥物、食品等科學領域。生命體作為復雜的手性系統，其中的氨基酸是生命物質的基石，作為手性分子(甘氨酸除外)，不同構型的氨基酸在生命科學及其他相關領域發揮著不同的作用。例如:L-氨基酸用于合成人體所需蛋白質，然而一些D-氨基酸不參與蛋白質的合成，兩者混淆會對生物體產生不良的反應[1]。色氨酸(Trp)是一種用以建立和維護良好人體氮平衡的重要營養成分，在蔬菜中的含量較少，因此多將其作為營養物質加入到藥物和食品中。Trp是復合氨基酸制劑和氨基酸注射液的重要組成部分，廣泛應用于醫藥、食品及飼料等方面。若缺乏這種Trp形成的蛋白質，人類無法生存。L-Trp被稱作第二氨基酸，是人體和動物體內一種重要的代謝物，Trp代謝失調會導致糖尿病和神經錯亂，其中L-Trp的代謝產物5-羥色胺可以促進睡眠和精神穩定，補充L-Trp可以明顯緩解抑郁癥患者的病情[2-3]。人體內L-Trp失衡或量不足還會導致多種慢性疾病[4-5]。L-Trp已經用作健康食品、安神藥物及飼料添加劑[6]。D-Trp作為一種非蛋白光學活性氨基酸，是抗癌和免疫藥物的重要前驅物質[7]。L-和D-Trp在應用領域中發揮著不同的作用，因此，創建簡捷方便、速度快、靈敏度高的Trp對映異構體的檢測方法具有十分重要的意義。目前Trp對映異構體的檢測方法有高效液相色譜法[8]、毛細管電泳法[9]、電化學方法[10-13]等，其中電化學方法因制備過程簡單、經濟、高靈敏度和高穩定性等優點而被廣泛研究[14-15]。

為提高電化學測量的靈敏度，將納米材料引入電化學傳感器領域，例如金納米粒子(AuNPs)[16]、碳納米管(CNTs)[17]、石墨烯[11]，這些材料由于具有比面積高、可促進電子轉移、增強導電性等特點，極大地促進了電化學傳感器的發展[18]，已成為修飾化學和生物傳感器電極材料的研究熱點。CNTs作為典型的代表，具有尺寸小、比表面積高、化學性質穩定等優良性質，常被用于修飾電極，不僅可以提高電極表面的電子傳遞能力，還能增大電極表面的負載量。大量研究表明CNTs修飾電極能顯著提高電化學響應信號。

殼聚糖(CS)是甲殼素脫去乙酰基的衍生物，是光學活性的陽離子型天然多糖，具有生物相容性、生物可降解性和無毒等特點。由于具有手性環境[19]，CS及其衍生物具有良好的手性識別能力，可用于手性化合物的識別和分離[20-22]。CS分子內具有配位能力的氨基和羥基，可與氨基酸上的羧基和氨基形成氫鍵，因此可用于Trp對映異構體的識別。Gu等[20]利用恒電位法沉積CS或磺化的CS(SCS)于電極表面，成功手性識別了Trp對映異構體，并檢測了L和D型Trp在外消旋混合物中的比例，SCS識別效果優于CS。Qu等[21]采用CV法在電極表面電沉積石墨烯量子點(GQD)-CS復合膜，利用GQD放大電化學信號及提高識別效率和CS的手性微環境，成功識別了Trp對映體。CS具有很好的成膜性，但其導電性和機械穩定性差。本文應用羧酸化的多壁碳納米管(f-MWCNTs)[23]來提高電化學傳感器的導電性和機械性能，再沉積CS(HCl作溶劑)成膜，從而擴展了天然多糖在手性識別領域的應用[24]。張軍麗等[25]以CS/f-MWCNTs復合膜修飾電極固定包埋辣根過氧化物酶后對H2O2的電催化氧化效果明顯提高。董曉婭等[26]研究了CS/f-MWCNTs復合膜對鄰、間、對硝基酚的同時檢測，方法具有很好的靈敏度和穩定性，并成功用于實際樣品的測定。

本實驗首先將f-MWCNTs分散液滴涂于GCE表面，然后恒電位法在上述電極表面電沉積CS膜，從而得到CS/f-MWCNTs復合膜，以f-MWCNTs膜為基底，CS為識別元件構建電化學傳感器，用于手性識別Trp對映異構體。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

L-Trp(層析純，中國惠興生化試劑廠)，D-Trp(生物試劑，成都艾科達化學試劑廠)，磷酸氫二鈉(分析純，天津市博迪化工廠)，磷酸二氫鈉(分析純，山東省化工研究院)，氯化鈉、無水乙醇、KCl(分析純，山東省萊陽市經濟開發區化工廠)，CS(生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF，分析純，天津市天河化學試劑廠)，鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀(分析純，萊陽化工實驗廠)，f-MWCNTs(直徑10～20 nm)，0.30、0.05 μm Al2O3粉末。實驗用水為超純水(電導率18.25 MΩ·cm)。

電化學實驗均在CHI-660C型電化學工作站上完成(上海市辰華儀器廠)，UV-2550紫外-可見分光光度計(日本島津公司)，電化學實驗采用傳統的三電極體系：裸GCE(直徑3 mm)或修飾GCE為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl(飽和KCl)作參比電極。

1.2 實驗方法

1.2.1溶液配制5.0 mg的f-MWCNTs加至2.5 mL DMF中超聲分散至少1 h，得到均勻分散液。CS溶于0.1 mol/L的HCl中，配制成2 g/L的CS溶液。通過磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶液配制不同pH值的0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS)。

1.2.2電極的修飾首先對未修飾GCE依次用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末拋光處理，超純水淋洗，然后分別在超純水、無水乙醇和超純水中超聲處理1 min，N2吹干。最后取3 μL的f-MWCNTs分散液滴到干凈的GCE表面，自然晾干，得f-MWCNTs修飾的電極。將該修飾電極浸于5 mL的CS溶液中，在-0.5 V恒電位下掃描150 s，使CS沉積到f-MWCNTs修飾電極表面，自然晾干。

1.2.3檢測方法DPV測量：不同的修飾電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl為參比電極，上述三電極浸于含0.5 mmol/LL-或D-Trp的25 mL 0.1 mol/L PBS溶液中溫育60 s(電勢范圍為0.4～1.0 V，靈敏度:1.0×10-4)。

CV測量：采用三電極體系在含10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中做CV測量。參數設置：初始電位-0.2 V，最高電位0.6 V，最低電位-0.2 V，掃速0.1 V/s，靈敏度1.0×10-4。

EIS測量：采用三電極在含10 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中做EIS分析。參數設置：初始電位設為開路電壓，最大頻率1.0×105，最小頻率0.01，其它參數不變。

圖1 f-MWCNTs/GCE(A)與CS/f-MWCNTs/GCE(B)的SEM表征圖Fig.1 SEM of f-MWCNTs/GCE(A)and CS/f-MWCNTs/GCE(B)

圖2 不同修飾電極在含10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的CV(A)和EIS(B)響應圖Fig.2 Cyclic voltammograms(A)and nyquist diagrams(B) of different electrodes in 0.1 mol/L KCl solution containing 10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-a.bare GCE,b.f-MWCNTs/GCE,c.CS/GCE,d.CS/f-MWCNTs/GCE

2 結果與討論

2.1 電極修飾材料的SEM表征

本實驗采用恒電位法在f-MWCNTs修飾的電極表面電沉積CS膜，隨著電流值的降低，CS逐漸沉積到電極表面，自然晾干完成CS在電極表面的修飾。

采用SEM表征了f-MWCNTs和CS/f-MWCNTs的表面形態。如圖1A所示，f-MWCNTs呈彎曲管狀網絡分布狀態，大的比表面積結構有利于增加電極的表面積[27]，也有利于CS有序的沉積。當CS沉積到f-MWCNTs修飾電極表面后(如圖1B)，可發現CS在f-MWCNTs表面形成互相編織的較為均一的密集網狀結構，CS在電極表面的負載量明顯增加，進而增加了手性識別位點，一方面由于f-MWCNTs的含氧基團為CS提供了大量活性位點，另一方面f-MWCNTs與CS發生靜電作用，電極的穩定性得到提高。

2.2 不同修飾電極的電化學特性表征

采用CV法(圖2A)研究了不同修飾電極在含10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的電化學特性，掃速為0.1 V/s。Trp在裸GCE上的CV曲線有1對可逆的氧化還原峰(曲線a)。當滴涂上f-MWCNTs后，電流響應信號明顯增大，峰電位差略有減小(曲線b)，說明f-MWCNTs不僅增大了電極的表面積，還促進了電子的傳遞。文獻報道顯示，當CS沉積到GCE表面后，峰電流明顯降低，且沒有可逆的氧化還原峰，峰電位產生較大偏移，這是由于CS的導電能力弱，不利于電荷的傳遞[28-29]。但本文將CS于0.1 mol/L HCl電解液中沉積于電極表面，CS膜由于質子化帶正電荷，與帶負電荷的[Fe(CN)6]3-/4-靜電相互作用增強，從而提高了CS/GCE的電化學行為(曲線c)。所以當進一步在f-MWCNTs修飾后的電極表面沉積CS膜后，峰電流明顯又增強(曲線d)，說明復合膜成功修飾于電極表面，CS和f-MWCNTs的結合使修飾電極的響應很靈敏，兩者之間對修飾電極起到良好的協同作用。

采用EIS對不同的修飾電極做進一步研究(圖2B)，并進一步說明電極和電解質溶液界面之間的阻抗差異，在EIS圖中低頻處的直線部分表示擴散控制過程，高頻處的半圓直徑代表電子轉移反應的電阻[30]。GCE的EIS圖高頻處的半圓展現了典型的界面電子轉移電阻(曲線a)，當f-MWCNTs修飾到電極表面后，高頻處的半圓幾乎消失(曲線b)，說明f-MWCNTs具有良好的導電性并促進了電極表面的電子傳輸。然而，CS/GCE高頻處的半圓遠小于GCE(曲線c)，說明CS成功修飾于電極表面，證實CS電極表面的電子傳輸和導電性比裸GCE好。CS/f-MWCNTs/GCE的 EIS曲線近似一條直線(曲線d)，f-MWCNTs和CS兩者的協同作用又使得復合膜修飾電極界面具有良好的導電性和靈敏度。結果證明不同電極的EIS行為與CV行為一致。

2.3 DPV檢測實驗條件優化

因為溫度、pH值可能對手性識別過程中的CS與Trp氫鍵作用產生影響，所以考察了溫度和pH值對Trp對映體在CS/f-MWCNTs/GCE上電化學反應的影響。結果發現低溫和高溫條件下，CS/f-MWCNTs復合膜與Trp對映體間的氫鍵作用比較微弱，Trp對映體識別效果不佳。在25 ℃條件下，CS/f-MWCNTs復合膜與Trp對映體間的氫鍵作用最強，識別效率最高。在酸性條件下，CS分子中的氨基被質子化，易溶于水，堿性條件下，CS分子中的氨基還原為中性，由于Trp的電負性，CS膜吸附Trp的量會減少。因此pH 7.0條件下，CS/f-MWCNTs 復合膜具有較為合適的靜電分布，能使Trp吸附量達到最大，識別效果最優。

2.4 最優條件下Trp對映體在不同修飾膜界面上的DPV響應

圖3 Trp對映異構體在CS/GCE(A)與CS/f-MWCNTs/GCE(B)上的DPV響應圖Fig.3 Differential pulse voltammograms of L-Trp and D-Trp bound to CS/GCE(A) and CS/f-MWCNTs/GCE(B)0.1 mol/L PBS(pH 7.0) at 25 ℃

在最優條件下，研究了Trp對映體在不同電極上的DPV響應。在0.4～1.0 V電位范圍內，Trp在不同電極上的DPV響應圖出現1個氧化峰。裸電極和f-MWCNTs/GCE上L-Trp和D-Trp的DPV響應曲線幾乎相互重合,說明Trp對映體在這兩種電極上不能得到區別，需要在電極表面提供手性環境。但相比GCE，f-MWCNTs/GCE上Trp對映體的峰電位負移為0.676 V，且峰電流值提高了4.6倍，表明f-MWCNTs促進了Trp的電化學氧化反應，對Trp對映異構體具有電催化作用。然而當CS修飾于電極上，L-Trp和D-Trp的DPV氧化峰電流值明顯發生了微弱的差異(如圖3A)，且L-Trp峰電流值大于D-Trp，峰電位也發生微弱的偏移。說明CS/GCE 對Trp對映異構體存在識別作用，由于不同的空間結構，CS/GCE與L-Trp的作用力強。如圖3B，識別效果在CS/f-MWCNTs/GCE上得到進一步提高，且峰電流比值(IL/ID)達到2.38，通過Trp對映體在CS/f-MWCNTs/GCE上的識別效果，可知識別能力是CS和f-MWCNTs的協同作用，相當于CS提供了手性微環境即對映體識別能力，f-MWCNTs不但提高了電子轉移效率，同時增大了電極的比表面積以及CS在GCE表面的負載量，提高了識別效率。實驗結果表明，CS手性微環境和f-MWCNTs形成復合膜增強了CS與Trp的識別作用，從而增加了手性識別的差異，使CS/f-MWCNTs/GCE成功識別Trp對映異構體。

2.5 Trp對映異構體的濃度對DPV響應信號的影響

為了研究不同濃度的L-Trp和D-Trp在CS/f-MWCNTs/GCE上的DPV響應，采用DPV法分別檢測0、0.008、0.5、1、2、4、5 mmol/L的L-Trp和D-Trp在CS/f-MWCNTs/GCE上的峰電流。結果顯示，峰電流值隨著Trp濃度的增大而增大，且與Trp濃度呈線性關系，Trp對映異構體的檢測線性范圍為8.0×10-6～ 4.0×10-3mol/L，檢出限(S/N=3)為5.0×10-6mol/L，L-Trp的線性方程為Ip=27.73cL-trp+19.26(r2=0.994 7)，D-Trp的線性方程為Ip=27.76cD-trp+8.09(r2=0.997 1)。結果表明，該復合膜具有檢測濃度范圍較寬，靈敏度較高，檢出限低等優點。

2.6 Trp與CS結合常數的測量

由于CS與Trp的結合常數與對映體選擇性識別有密切的關系，利用紫外可見光譜(UV-Vis)測量了Trp對映異構體與CS的結合能力差異。結果顯示，L-Trp和D-Trp在278 nm處的吸光度隨著CS量的增加而增大，根據Trp在278 nm處的紫外吸收特征峰的吸光度來計算CS與Trp的結合常數[31]。CS和Trp對映異構體之間的穩定結合常數見表1。依據文獻計算方法[32]，通過下式得CS和Trp對映異構體的化學計量比和穩定結合常數。

表1 CS和Trp在25 ℃時不同pH值下的結合常數Table 1 Binding constant(K) for D- and L-Trp with CS at 25 ℃ with various pH values

3 結 論

本文以f-MWCNTs修飾的GCE為基底電極，在其表面電沉積CS膜，構建CS/f-MWCNTs復合膜修飾的電化學傳感器，并用于Trp對映異構體識別。實驗結果表明，該復合膜對L-Trp的識別能力強于D-Trp。該方法具有響應快速、檢測簡單、成本低等優點，為該電化學傳感器用于其它手性化合物的分析提供了一定的參考價值。

[1] Gopal R,Seo C H,Song P I,Park Y.AminoAcids,2013,44(2):645-660.

[2] Ray J M,Bauerle R.J.Bacteriol.,1991,173(6):1894-1901.

[3] Sloan M J,Phillips R S.Biochemistry,1996,35(50):16165-16173.

[4] Suzuki Y,Suda T,Furuhashi K,Suzuki M,Fujie M,Hahimoto D,Nakamura Y,Inui N,Nakamura H,Chida K.LungCancer,2010,67(3):361-365.

[5] Schruers K,Griez E.JournalofAffectiveDisorders,2003,74(3):107-119.

[6] Zuo Z Z,Huang Q G,Wu W B,Cai A J,Weng X Q,Zhao Y Y,Shi Q Q.AnhuiAgric.Sci.Bull.(左祖楨,黃欽耿,吳偉斌,蔡愛金,翁雪清,趙燕玉,施巧琴.安徽農學通報),2010,16(7):38-40.

[7] Wang D H,Wei P,Ouyang P K.ChemicalIndustry&EngineeringProgress(王大慧,韋萍,歐陽平凱.化工進展),2002,21(2):103-105.

[8] Zhen Q N,Xu B,Li M,Tian G,Tang X F,Ding M.Clin.Biochem.,2011,44(2/3):226-230.

[9] Simionato A V,Moraes E P,Carrilho E,Tavares M F,Kenndler E.Electrophoresis,2008,29(10):2051-2058.

[10] Zor E,Hatay P I,Bingol H,Ersoz M.Biosens.Bioelectron.,2013,42(1):321-325.

[11] Feng W L,Liu C,Lu S Y,Zhang C Y,Zhu X H,Liang Y,Nan J M.Microchim.Acta,2014,181(5):501-509.

[12] Kang S Z,Chen H,Li X Q,Mu J.DiamondRelat.Mater.,2010,19(10):1221-1224.

[13] Yu L Y,Liu Q,Wu X W,Jiang X Y,Yu J G,Chen X Q.RscAdv.,2015,5(119):98020-98025.

[14] Xu C X,Huang K J,Fan Y,Wu Z W,Li J,Gan T.Mater.Sci.Eng.C,2012,32(4):969-974.

[15] Xu T,Jia X L,Chen X,Ma Z.Biosens.Bioelectron.,2014,56(3):174-179.

[16] Rezaei B,Rahmanian O,Ensafi A A.Sens.ActuatorsB,2014,196:539-545.

[17] Peng D M,Yu L Y,Yu J G,Jiao F P,Peng Z G,Zhang T.CurrentNanoscience,2013,9(5):631-634.

[18] Chang C L,Wang X,Bai Y,Liu H W.TrendsAnal.Chem.,2012,39(2):195-206.

[19] Wang H D,Chu L Y,Song H,Yang J P,Xie R,Yang M.JournalofMembraneScience,2007,297(1/2):262-270.

[20] Gu X G,Tao Y X,Pan Y,Deng L Y,Bao L P,Kong Y.Anal.Chem.,2015,87(18):9481-9486.

[21] Ou J,Tao Y X,Xue J J,Kong Y,Dai J Y,Deng L H.Electrochem.Commun.,2015,57:5-9.

[22] Tang S,Liu J D,Bin Q,Fu K Q,Wang X C,Luo Y B,Huang S H,Bai Z W.J.Chromatogr.A,2016,1440(1):112-122.

[23] Guo D M,Huang Y H,Chen C,Chen Y,Fu Y Z.NewJ.Chem.,2014,38(12):5880-5885.

[24] Son B C,Park K,Song S H,Yoo Y J.KoreanJ.Chem.Eng.,2004,21(6):1168-1172.

[25] Zhang J L,Li R L,Pan Q C.J.Instrum.Anal.(張軍麗,李瑞玲,潘慶才.分析測試學報),2016,35(10):1351-1354.

[26] Dong X Y,Wang Z H,Qiu B J,Guan X P.J.Instrum.Anal.(董曉婭,汪振輝,邱白晶,管賢平.分析測試學報),2014,33(11):1250-1255.

[27] Fang B,Wei Y,Li M G,Wang G F,Zhang W.Talanta,2007,72(4):1302-1306.

[28] Li J J,Yuan R,Chai Y Q,Che X,Li W J,Zhong X.Microchim.Acta,2011,172(1):163-169.

[29] Zheng M X,Gao F,Wang Q X,Cai X L,Jiang S L,Huang L Z,Gao F.MaterialsScience&EngineeringC,2013,33(3):1514-1520.

[30] Yan J Y,Song H H,Yang S B,Yan J Y,Chen X H.Electrochim.Acta,2008,53(22):6351-6355.

[31] Selvakannan P R,Mandal S,Phadtare S,Gole A,Pasricha R,Adyanthaya S D,Sastry M.J.ColloidInterfaceSci.,2004,269(1):97-102.

[32] Benesi H A,Hildebrand J H.J.Am.Chem.Soc.,1949,71(1):2703-2707.

[33] Shanmugam M,Ramesh D,Nagalakshmi V,Kavitha R,Rajamohan R,Stalin T.Spectrochim.ActaPartA,2008,71(1):125-132.

Enantioselective Recognition of Tryptophan Enantiomers Using Chitosan/Multi-walled Carbon Nanotube Modified GCE

ZHANG Ya-hui,XU Hui*,LIU Gang

(School of Chemistry and Materials,Ludong University,Yantai 264025，China)

The dispersed multiwalled carbon nanotubes with carboxyl(f-MWCNTs) were firstly dropped on the glass carbon electrode to allow a f-MWCNTs menbrance formed on the electrode surface,then chitosan(CS) was electrodeposited on the surface of the eletrode via potentiostatic method to develop a CS/f-MWCNTs/GCE which was used for the chiral recognition of tryptophan enantiomers.The surface morphology of the eletrode was characterized via scanning electron microscopy(SEM).Cyclic voltammetry(CV) and electrochemical impedance spectroscopy(EIS) were used to investigate the electrochemical behavior difference of the modified electrode.Differential pulse voltammetery(DPV) was employed to investigate the stereospecific recognition of tryptophan(Trp) enantiomers with a separation coefficient of 2.38.The results showed that the CS/f-MWCNTs/GCE displayed a more strong DPV response forL-Trp than that forD-Trp in the linear range of 8.0×10-6-4.0×10-3mol/L with a detection limit of 5.0×10-6mol/L(S/N=3).Meanwhile,it provided a beneficial reference for the discrimination of other chiral enantiomers.

chitosan;tryptophan;enantioselective recognition;electrochemical method

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.007

O657.1；TP212.2

A

1004-4957(2017)10-1208-06

2017-05-08；

2017-06-22

山東省自然科學基金(ZR2016BM27);山東省重點研發計劃(2016GNC111016);煙臺市重點研發計劃(2016ZH059)

*

徐 慧，博士，教授，研究方向：納米生物傳感器，Tel:0535-64253159，E-mail:xuhui235@163.com