TLR9、MyD88在顳葉癲癇大鼠海馬組織中表達的動態變化

吳興饒， 孔慶霞， 褚 旭

TLR9、MyD88在顳葉癲癇大鼠海馬組織中表達的動態變化

吳興饒1， 孔慶霞2， 褚 旭2

目的觀察氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠各期海馬中Toll-樣受體9(TLR9)、髓樣分化因子(MyD88)表達的變化，探討其是否與顳葉癲癇發生有關。方法SD雄性大鼠120只，隨機分為對照組(30只)和模型組(90只)，腹腔注射氯化鋰。18 h～20 h后模型組腹腔注射匹羅卡品誘導癲癇持續狀態(SE)；對照組予等量生理鹽水取代匹羅卡品腹腔注射。對照組和造模成功的模型組依據腹腔注射后時間隨機分為10個亞組：急性模型組(SE后3 h、6 h、9 h、12 h、1 d、3 d、7 d)；潛伏模型組(SE后14 d、28 d)；慢自發發作組(SE后56 d)。每亞組動物模型組9只，對照組3只。免疫組化、蛋白印跡、RT-PCR 技術測定各亞組癲癇大鼠海馬內TLR9、MyD88的表達。結果TLR9、MyD88在模型組海馬內表達明顯增多，與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。模型亞組內，TLR9、MyD88在急性期和慢性期表達明顯增高，而潛伏期無明顯表達變化。其中急性期內的增高多集中在癲癇發作后6 h；3組比較差異有顯著性(P<0.05)。結論大鼠海馬內TLR9、MyD88表達增多可能與顳葉癲癇發病有關，探討其機制可能為顳葉癲癇的治療提供新的靶點。

顳葉癲癇； TLR9； MyD88； 細胞因子

癲癇是神經內科的常見疾患之一，多數經藥物治療可緩解，但有約30%患者藥物治療無效，成為難治性癲癇。參與癲癇的發病機制十分復雜，迄今尚未完全闡明，近幾年研究證實免疫炎癥反應與癲癇的發生、發展密切相關，患者腦脊液(CSF)和血清中的促炎性細胞因子水平的增加提供了神經炎癥在癲癇發生發展中參與的證據，而這些細胞因子多是由外源性和內源性配體的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)通過激活產生的。

TLRs是一類天然免疫的模式識別受體，屬于跨膜蛋白，由富含亮氨酸重復序列組成的胞膜外區、跨膜區以及與1L-1受體胞內區保守序列有高度同源性的胞漿區組成，其能夠識別微生物脂質、碳水化合物、蛋白質或核酸，而在先天性免疫系統中發揮關鍵作用。目前與癲癇有關的TLRs主要有TLR1、TLR3、TLR4、TLR9，其中TLR1、TLR3、TLR4報道的比較多。而TLR9、MyD88是否與難治性癲癇有關，其在難治性癲癇中的表達情況如何，國內外極少報道。本研究利用氯化鋰-匹羅卡品點燃大鼠，制備難治性顳葉癲癇模型，結合免疫組化、免疫印跡、RT-PCR技術測定各期大鼠海馬內TLR9、MyD88的表達。旨在探討其與顳葉癲癇發生發展的相關性，為顳葉癲癇的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物健康雄性Sprague Dawley大鼠(山東魯抗實驗動物中心，生產許可證scxk魯20140007)，倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)、恒冷切片機(德國Leica 公司)、熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)、轉移電泳儀、垂直式電泳槽、電轉移槽(北京市六一儀器廠)、氯化鋰、匹羅卡品、甲基化阿托品(美國Sigma)，抗TLR9一抗(英國Abcam)，水合氯醛、普魯士藍試劑盒(北京索萊寶公司科技有限公司)，TLR9、MyD88引物(生工生物工程上海股份有限公司)，生理鹽水(山東魯抗醫藥股份有限公司)，無水乙醇、甲醇、氯化鈉、多聚甲醛等實驗室常用藥品(山東省萊陽市鐵塔化工用品廠)等。

1.2 實驗動物顳葉癲癇模型制作及分組 選擇健康雄性Sprague Dawley大鼠130只，隨機分對照組(30只)和造模組(100只)，體重200～250 g，環境為清潔級，溫度維持20 ℃，分籠飼養，飼以標準飼料，自由飲水，固定12 h人工晝夜循環的環境。采用氯化鋰-皮羅卡品誘導急性顳葉癲癇模型，具體方法如下：所有SD大鼠第一天提前18～20 h腹腔注射氯化鋰(LiCl)127 mg/kg；第2天提前30 min腹腔注射溴化甲基阿托品1 mg/kg，30 min后造模組腹腔注射新鮮配置的匹羅卡品30 mg/kg，并按照Racine癲癇行為標準觀察記錄大鼠行為30 min，若大鼠未達到Racine分級的Ⅳ～Ⅴ級的癇性發作，繼續追加匹羅卡品的劑量，每隔10 min重復注射匹羅卡品一次，每次為10 mg/kg，最大追加劑量可達60 mg/kg。發作級別達Racine分級Ⅳ～Ⅴ級，發作持續1 h以上視為成功的顳葉癲癇模型。對照組則予等量生理鹽水取代匹羅卡品腹腔注射。造模組內，在造模成功且存活的顳葉癲癇模型中，按照隨機數字表法隨機挑選出90只大鼠編為模型組進行實驗，共分3個大組，10個亞組:急性模型組(SE后3 h、6 h、9 h、12 h、1 d、3 d、7 d)；潛伏模型組(SE后2 w、4 w)；慢自發發作組(SE后8 w)及相對應時間點對照組。每亞組動物模型組9只，對照組3只。

1.3 免疫組化分析檢測TLR9蛋白在海馬中的表達

1.3.1 腦組織取材 模型組及對照組大鼠均在造模后的相應時間點立即進行心臟灌注后取腦組織，首先麻醉、固定，依次以0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛經心臟灌注固定，分離腦組織置4%的多聚甲醛4 ℃ 過夜固定，后放入30%的蔗糖溶液中4 ℃浸泡至組織塊沉底，后于海馬吻合位置連續冠狀冰凍切片，片厚4 μm，-80 ℃保存備用于免疫組化。每亞組取模型組3只大鼠，對照組1只大鼠。

1.3.2 免疫組化分析檢測TLR9蛋白的表達 免疫組化步驟參照SABC-AP免疫組化染色試劑盒(博士德SA1052-兔Ig-G)說明書操作。冰凍切片于4 ℃下復溫30 min，室溫置于30% H2O2和純甲醇混合液中(1∶50)30 min，以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次后，加入5%BSA封閉液，室溫30 min。加入稀釋的一抗(TLR9，1∶100;購于abcam公司) 4 ℃孵育過夜。取出后PBS清洗3次，每次5 min。滴加相應的二抗(生物素化山羊抗兔Ig-G)，室溫30 min，PBS清洗3次，每次5 min。滴加SABC-AP，室溫30 min，PBS洗5 min×3次。BCIP/NBT染色，鏡下觀察，控制顯色時間。流水充分沖洗，蘇木素染核，常規封片。實驗重復3次。

1.4 Western blot檢測TLR9蛋白在海馬中的表達

1.4.1 海馬總蛋白的提取 取造模后相應時間點的模型組及對照組大鼠，常規用10%水合氯醛(劑量300 mg/kg)麻醉后斷頭取腦，分離海馬。液氮下研磨組織成粉末狀，加入NP40組織裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑，冰上裂解1 h，14000 r/min離心20 min，取上清，分裝并凍存在液氮中備用。每亞組取模型組3只大鼠，對照組1只大鼠。

1.4.2 Western blot檢測TLR9蛋白的表達 取出備用的各組海馬總蛋白,以30 μg上樣量，加入上樣緩沖液后，標本煮沸5 min，然后迅速置于冰面冷卻，上樣，12%聚丙稀酰胺凝膠電泳分離(上層膠電泳電壓70 V，1 h；下層膠電泳電壓110 V，1 h)，轉膜(轉膜電壓80 V，90 min)、封閉后，與一抗IL-1β/TLR9(1∶1000 濃度)4 ℃孵育過夜，與1∶2000濃度的HRP標記的相應二抗室溫解育1 h后，ECL試劑發光，顯影和定影。實驗重復3次。

1.5 RT-PCR檢測TLR9 mRNA、MyD88 mRNA在海馬中的表達

1.5.1 海馬總RNA的提取 取造模后相應時間點的模型組及對照組大鼠，常規用10%水合氯醛(劑量300 mg/kg)麻醉后斷頭取腦，分離海馬。液氮下研磨組織成粉末狀，按TRIzor法提取細胞RNA，紫外分光光度計測定其純度和含量，OD260/OD280比值在1.8～2.0之間證明樣本純度好。每亞組取模型組3只大鼠，對照組1只大鼠。

1.5.2 RT-PCR檢測TLR9 mRNA、MyD88 mRNA的表達 總RNA (1 μg)以Oligo dTPrimer為引物進行逆轉錄，操作按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(廣州復能基因有限公司)說明進行。逆轉錄產物擴增采用2×Taq PCR Master Mix試劑盒(廣州復能基因有限公司)，并參照其說明進行。TLR9、MyD88和β-Actin 引物(上海生工生物工程公司合成)擴增大小分別為243 bp、452 bp。TLR9：上游序列：5’-TGCCTTCCTACCCTGTGAAC-3’，下游序列：5’-AGGAAAGGCTGGTGATGTTG-3’；MyD88：上游序列：5’-GATCCCACTCGCAGTTTGTT-3’，下游序列：5’-GATGCGGTCCTTCAGTTCAT-3’；β-Actin：上游序列：5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游序列：5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’；反應條件：95 ℃預熱10 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s；循環25次。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 造模情況 SD大鼠腹腔注射匹羅卡品10 min后開始出現排便排尿軀體抖動行動刻板等，直至最終出現全身強直-陣攣癲癇大發作，待發作持續1 h以上后給予水合氯醛終止發作，并加強呼吸道護理，給予葡萄糖奶粉能量支持，降低死亡率。造模成功率為95%(100只大鼠，95只成功建立急性期模型，后死亡2只，存活93只)，從成功癲癇模型中隨機選擇90只癲癇大鼠用于模型組實驗研究。

2.2 免疫組化結果 正常對照組大鼠海馬組織中可見少量TLR9陽性細胞，而模型組內染色陽性細胞增多，呈棕黃色或紅褐色，染色均一，多表達在細胞的胞漿，以點狀或者串珠樣分布，偶可見斑片狀分布，表達明顯部位常伴有細胞形態改變。與對照組相比，模型組海馬內TLR9表達增多，差異有顯著性。模型各亞組內TLR9蛋白急性期和慢性期表達增高顯著，但潛伏期表達增多不明顯；3組比較差異有顯著性，且在急性期各組內明顯見到差異，以3 h、6 h時期增高較為顯著(見圖1)。

2.3 Western-blot結果 與對照組相比，TLR9 蛋白在模型組海馬內表達明顯增多(P<0.05)。模型亞組內，急性期和慢性期TLR9蛋白表達增高顯著，而潛伏期無明顯表達變化；3組比較差異有顯著性，且在急性期各組內明顯見到3 h，6 h時期的顯著增高(見圖2)。

2.4 RT-PCR結果 對照組相比,TLR9 mRNA、MRP8 mRNA在模型組海馬內表達增多。模型組內，TLR9 mRNA、MRP8 mRNA在急性期和慢性期表達顯著增多(P<0.05)，潛伏期表達無明顯改變； 在急性期各亞組內明顯見到3 h，6 h時期的顯著增高(P<0.05)(見圖3)。

圖1 各組大鼠海馬內TLR9 表達變化(箭頭所示)×200倍

圖2 a、c：TLR9在各亞組海馬中動態表達的變化； b、d：β-actin在各亞組海馬中表達的變化

圖3 a、b:TLR9 mRNA、MyD88 mRNA在各亞組海馬中動態表達的變化

3 討 論

癲癇是大腦神經元突發性異常放電，導致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病，其表現具有發作性、反復性、刻板性的特點。癲癇發作可導致神經元選擇性損傷，甚至死亡，其對神經系統的損害并非隨著放電的終止而停止，一次癲癇的急性發作就足以引起腦部邊緣葉特定區域神經元的脫失[1,2]。在氯化鋰-匹羅卡品誘導的癲癇動物模型中，癇性發作包括急性邊緣性發作，其進一步可發展為癲癇持續狀態(epileptic state,SE)，即進入急性期，急性期后伴隨一個潛伏期及稍后出現的自發性再發作階段，最后出現以自發性反復癲癇發作為特征的慢性癲癇階段。癲癇持續狀態可引起海馬神經元的神經病理改變，導致相關神經元的壞死、變性或凋亡，神經元內DNA進而釋放出來。TLR9作為族中唯一識別DNA的受體，經典配體是非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸序列DNA(CpG-DNA)，其活化的信號傳導屬于典型的髓樣MyD88依賴性信號轉導途徑。國外研究發現TLR9有起到維持大腦結構完整性的神經保護作用。Taito Matsuda等人[3]通過動物實驗發現成年大鼠海馬小膠質細胞的TLR9能夠識別變性神經元的自身DNA活化，分泌TNF-α(腫瘤壞死因子-α)，通過調節神經干細胞/祖細胞的增生來削弱由癇性發作引起的異常神經再生。也有報道指出癲癇患者海馬神經元損傷的DNA能夠刺激小神經膠質TLR9，由此引發的TNF-α產生通過NF-κB信號傳導途徑，影響海馬齒狀回神經祖細胞的減少[4,5]，而對TLR9敲除的癲癇小鼠的研究中，其癲癇發作的頻率和時間都要比野生型癲癇小鼠更為嚴重。Tauber SC等人[6]通過Morris水迷宮測試發現，通過連續注射的CpGDNA，刺激TLR9，能夠導致小鼠的認知功能障礙，從一定程度上暗示TLR9與癲癇有一定聯系，但具體作用尚未明確。我們推測癲癇發作引起神經元壞死等釋放的DNA可作為TLR9配體，進而激活TLR9，又通過細胞內一系列銜接分子如MyD88等的相關作用，激活NF-κB等一系列信號途徑，引起相關炎癥介質的表達，導致炎癥反應的發生。

在本實驗中，TLR9在顳葉癲癇大鼠海馬內表達增多，暗示TLR9在癲癇中具有潛在研究價值。其中急性期及慢性期表達增高較潛伏期顯著，潛伏期無明顯表達變化，提示TLR9的表達變化與模型組大鼠癲癇發作呈相關性。我們推測，癲癇發作所致神經元等腦內神經細胞的損傷，釋放的DNA可能是TLR9被激活的原因。在癲癇發作初期，血腦屏障未完全破壞打開，TLR9增高并不顯著。Michalak[7]等在海人酸急性癲癇模型中的研究也證實癲癇持續狀態后血腦屏障通透性會增加并于SE后4 h～24 h血腦屏障通透性最大，急性期內TLR9的增高多集中在癲癇發作后6 h左右或與此有關。隨著病情進展，腦屏障逐漸破壞打開，大量星形膠質細胞增生及膠質化，這也可能是慢性期TLR9增高的一個原因，我們觀察到大約7 d左右，TLR9還會有一個上升趨勢，可能是由于癲癇大鼠處于自發性發作階段。實驗結果還顯示，MyD88在難治性顳葉癲癇大鼠海馬內表達在一致性，間接表明TLR9活化的信號傳導屬于典型的髓樣MyD88依賴性信號轉導途徑，而二者相互作用關系如何？MyD88能否單獨在癲癇中發揮一定作用？目前國內外少有報道。

TLR9在中樞神經系統(CNS)的神經元和膠質細胞中都有表達，且主要存在于具有吞噬作用的小膠質細胞中。目前，大量的研究已經證實由TLR9信號通路參與的炎癥反應起到了神經損傷作用。 Derkow等[8]研究發現，TLR9特有配體通過激活小膠質細胞后分泌一些可溶性因子，包括IL-1β和IL-23，從而引起依賴MyD88途徑的γ、δT細胞的激活，使IL-17分泌，進而引起了對神經元的毒性作用，這種毒性作用需要神經元與γ、δT細胞之間的直接聯系。Rosenberger等人[9]在研究單個和兩兩激活小膠質細胞內的TLRs對神經炎癥反應和退行性變的影響時，還發現TLR2、TLR4、TLR9的兩兩激活比各個單個激活引起了更嚴重的炎癥反應。如前所述，國外最新研究也指出，TLR9有起到維持大腦結構完整性的神經保護作用，暗示其在神經保護方面的作用。由此可見TLR9在癲癇病理過程中的作用機制復雜，正性及負性的調控均存在于病理過程之中。 我們推測，癲癇發作后，激活的小膠質細胞可以分泌促炎因子或抗炎因子，執行其神經損傷和神經保護雙向作用，TLRs則是小膠質細胞執行雙向作用的一類很關鍵的受體蛋白。TLR9在不同的中樞神經系統疾病中所起到的作用是不同的，在癲癇疾病中，類似的相關研究比較少，或者TLR9本身分泌了多種因子，既有IL-1β、IL-17等促炎因子，也有TNF-α等抗炎因子，或者其神經保護作用被同時激活的TLR4等作用較強信號通路的神經損傷作用所掩蓋，目前尚不能明確，這也是我們下一步將要探討的問題。

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DynamicexpressionchangesofTLR9andMyD88inhippocampusoftemporallobeepilepsyrats

WUXingrao,KONGQingxia,CHUXu.

(GraduateSchool,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

ObjectiveTo investig ate the dynamic expression changes of TLR9 and MyD88 in hippocampus of the epilepsy rats induced by from lithium chloride-pilocarpine during the development of epilepsy，and to explore whether they induced the pathogenisis of the temporal lobe epilepsy.Methods120 male healthy Sprague-Dawley rats were divided randomly into control group and LiCl-Pilocarpine experimental group.The experimental rats were intraperitoneally injected with LiCl (127 mg/kg) and Pilocarpine (30 mg/kg) to induce status epilepticus(SE).SE was stopped with 10% chloral hydrate intraperitoneally injecting 60 minutes later.The rats in the control group and the experimental group were randomly divided into 10 subgroups:acute group (3 h,6 h,9 h,12 h,1 d,3 d,7 d),latent group (2 w,4 w),chronic group (8 w).Survival rats were continuously observed for onset and recurrence of spontaneous seizures every day and were grouped and sacrificed at corresponding time after the last pilocarpine injection respectively.The control rats were mitted tales doses of 0.9% saline and grouped and sacrificed at the same time after the saline injection.And all groups were executed by using immunohistochemistry，Western-blotting and RT-PCR analysis to examine the dynamic expression of TLR9 and MyD88 in the subfields of each gourps hippocampus.ResultsCompared with control group，the expression of TLR9 and MyD88 increased in all of the model group (P<0.05).In all of model group,the expression of TLR9 and MyD88 increased more significantly in acute stage and chronic stage than the latent stage(P<0.05).Acute phase increase more concentrated in 6 h.ConclusionThe evelated expressions of TLR9 and MyD88 in epilepsy rat hippocampus indicate they could be responsible for the epileptogensis of temporal lobe epilepsy.The TLR9/MyD88 pathway may play an important role in the pathogenisis of temporal lobe epilepsy.

Temporal lobe epilepsy; TLR9; MyD88; Cytokines

R742.1

A

1003-2754(2017)10-0888-05

2017-06-15；

2017-09-28

國家自然科學基金面上項目(No.81371423);濟寧市科技發展計劃項目[濟科字(2015) 57號-94]

(1.天津醫科大學研究生院，天津 300070;2.濟寧醫學院附屬醫院神經內科，山東 濟寧 272000)

孔慶霞，E-mail:kqx1970@aliyun.com