甘草甜素對癲癇持續狀態大鼠神經保護作用及機制研究

王 林， 李亞軍， 張 蓓， 常明則， 石少亭， 張世俊， 折 瀟， 楊春梅

甘草甜素對癲癇持續狀態大鼠神經保護作用及機制研究

王 林1,2， 李亞軍2， 張 蓓2， 常明則3， 石少亭2， 張世俊2， 折 瀟2， 楊春梅1

目的研究甘草甜素(glycyrrhizin,GL)對癲癇持續狀態大鼠(status epilepticus,SE)神經損傷保護作用及相關分子機制。方法取清潔健康成年雄性SD大鼠60只，采用腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品的方法建立大鼠癲癇持續狀態(SE)模型，隨機分為甘草甜素組(SE+GL)和生理鹽水組(SE+S)，分別經尾靜脈給予甘草甜素及生理鹽水進行干預，取正常大鼠作為對照組(control group,C)；根據給予GL劑量不同將其分為高劑量組(HGL,20 mg/kg)、中劑量組(MGL,10 mg/kg)及低劑量組(LGL,5 mg/kg)；通過尼氏染色(NS)觀察各組大鼠SE后24 h時大腦皮質神經元損傷情況，分別采用酶聯免疫吸附法(ELISA)和蛋白印跡實驗(Western blot)檢測各組大鼠SE后24 h時血清及大腦皮質中高遷移率族蛋白(HMGB1)的表達水平。結果SE+S組大鼠大腦皮質神經元在癲癇持續狀態后24 h明顯受損，SE+GL各組皮質受損神經元數量較SE+S組減少，且在不同給藥劑量組間存在顯著差異(P<0.05)；SE+GL各組在SE后24 h時大腦皮質及血清中HMGB1的表達水平較SE+S組顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論經尾靜脈給予GL能有效地減少SE后大鼠大腦皮質神經元損傷，且其神經保護作用呈劑量依賴性，其機制可能與其抑制血清及大腦皮質炎性因子HMGB1的表達有關。

癲癇持續狀態； 甘草甜素； 大腦皮質神經元； HMGB1

癲癇是大腦神經元突發異常放電引起的一種神經功能障礙綜合征，目前全世界約有5000萬人罹患癲癇，目前的治療措施較多，約有60%～70%的癲癇患者病情得到控制，但仍有部分患者治療效果有限或并發癥較多，因而進一步探索抗癲癇損傷神經保護途徑及機制顯得愈發重要[1]。高遷移率組蛋白(high mobility group box-1 protein,HMGB1)的抑制劑甘草甜素(glycyrrhizin,GL)對中樞神經系統疾病如大鼠出血性和缺血性卒中的腦保護作用及機制已得到越來越多的關注[2～6]，但GL在大鼠SE后的神經保護作用及相關分子機制尚未見報道。本研究通過建立氯化鋰-匹羅卡品誘導大鼠癲癇發作并依據Racine分級標準篩選SE模型[7]，經大鼠尾靜脈給予GL或生理鹽水進行干預，采用尼氏染色(nissl staining,NS)、酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白印跡實驗(western blot,WB)觀察各組大鼠SE后24 h大腦皮質神經元損傷情況以及不同藥物劑量組大腦皮質與血清中HMGB1表達水平的改變，旨在探索GL在大鼠癲癇持續狀態后的神經保護作用及相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與設備 造模用氯化鋰、匹羅卡品、甘草甜素(貨號-1295888)均購于Sigma Aldrich公司(中國)，兔抗大鼠HMGB1多克隆抗體、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體均購于BOSTER公司(中國武漢)，紫外分光光度儀為BIO-RAD公司(美國)，高速冷凍離心機為Fermentas公司(加拿大)，ELISA試劑盒(HMGB1)購于BIO-RAD公司(美國)，石蠟切片機為LEICA公司(德國)，光學顯微鏡為NIKON公司(日本)。

1.2 動物分組及癲癇持續狀態模型建立 健康清潔級成年(6～8 w)雄性SD大鼠60只，購于西安交通大學實驗動物中心，自由飲水，標準飼料喂養，適應新環境1 w后造模。SE模型：采用Costa-Ferro等沿用的方法建立SE模型[7,8]，將大鼠依次稱重后依次經腹腔給予氯化鋰(127 mg/kg)，在20 h后經腹腔注射阿托品(0.1 mg/kg)以降低匹羅卡品的外周膽堿能反應，在給予阿托品后半個小時，腹腔注射匹羅卡品(40 mg/kg)，觀察大鼠癲癇發作的程度，根據經典的Racine分級標準[7]篩選入組大鼠，達到Ⅳ級或以上的SE大鼠納入實驗，在SE后30 min經腹腔給予地西泮(10 mg/kg)終止發作。隨機分為甘草甜素組(SE+GL，n=36)、生理鹽水組(SE+S，n=15)和正常對照組(control group C，n=9)，SE+GL組在大鼠SE終止后30 min經尾靜脈單次劑量GL，根據不同給藥劑量分為3個亞組(每亞組n=12)，高劑量組(high glycyrrhizin group,HGL,20 mg/kg)；中劑量組(middle glycyrrhizin group,MGL,10 mg/kg)；低劑量組(low glycyrrhizin group,LGL,5 mg/kg)，SE+S組大鼠經尾靜脈給予相同劑量的生理鹽水，C組為正常大鼠未作處理。

1.3 Nissl染色計數皮質神經元數量 為觀察各組大鼠(n=4)大腦皮質神經元數量，每組大鼠在SE造模成功后24 h經腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉后，4%多聚甲醛進行體內灌注固定后并取出大鼠完整大腦，將腦組織置入4%多聚甲醛中后固定36 h，之后經脫水、透明、浸蠟、包埋制作為石蠟組織塊。在石蠟切片機上做冠狀連續切片，切片厚度為1 μm。恒溫箱烤干后進行尼氏染色，圖像處理用Image proplus 6.0軟件進行，計算出各組大鼠大腦皮質神經元數量。

1.4 ELISA測定各組大鼠血清中HMGB1的表達 采用ELISA法測定各組大鼠(n=4)血清中HMGB1表達水平。各組大鼠在SE后24 h經腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剪開大鼠胸腔，直視下經大鼠右心房取血2 ml，在4 ℃冰箱中靜置30 min后，3000 r/min離心20 min，取上清液，根據ELISA試劑盒中操作步驟進行檢測各組樣本的OD值，通過依據標準品OD值及濃度所建立的線性回歸方程計算出各組大鼠血清中HMGB1的濃度(μg/L)，最后進行統計學分析。

1.5 Western blot測定各組大鼠大腦皮質中HMGB1的表達 采用Western blot測定各組大鼠(n=4)大腦皮質中HMGB1表達水平。剪開取血標本后的大鼠頂骨，取出大鼠完整大腦及小腦組織，冰上切除小腦后快速分離雙側大腦皮質，將分離好的各組大鼠雙側大腦皮質在微量電子稱上稱重后進行總蛋白提取、蛋白濃度定量、SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉和雜交、顯影反應及Image-Pro Plus 軟件進行條帶光密度分析。

2 結 果

2.1 GL對SE后大鼠大腦皮質神經元的保護作用 正常對照組大腦皮質神經元排列規律，細胞形態規則，細胞膜完整，細胞核清晰；生理鹽水組在SE后24 h大腦皮質神經元排列紊亂，細胞體積減小，形態不規則，細胞皺縮，細胞漿濃集，細胞核不清晰；而與生理鹽水組相比，GL組大鼠大腦皮質神經元受損程度明顯減輕，HGL組、MGL組及LGL組皮質正常神經元密度均高于生理鹽水組，其中HGL組及MGL組皮質神經元密度較生理鹽水組顯著增高(P<0.005)，且高于LGL組(P<0.05)，但在HGL組和MGL組兩組間比較無顯著統計學差異(P>0.05)。尼氏染色結果顯示經尾靜脈給予GL能夠減少大鼠SE后大腦皮質受損神經元數量，對SE后大鼠大腦皮質神經元損傷有保護作用(見圖1)。

2.2 GL對SE后大鼠血清中HMGB1表達的影響 采用ELISA檢測SE后24 h各組大鼠血清中HMGB1的表達水平，結果顯示HGL組、MGL組及LGL組HMGB1的表達水平較SE+S組均顯著降低(P<0.05)，且隨著GL劑量的增加，血清中HMGB1的水平降低幅度越顯著，表明GL能夠有效地降低SE后的大鼠血清中升高的HMGB1水平，且呈劑量依賴性，其差異有統計學意義(P<0.01)(見圖2)。

2.3 GL對SE后大鼠大腦皮質HMGB1表達的影響 采用Western-blot檢測各組大鼠大腦皮質中HMGB1的表達水平，結果顯示大腦皮質HMGB1的表達情況與血清中的相似，SE+S組的大鼠大腦皮質中HMGB1表達水平顯著高于其他各組，與SE+S組相比，HGL組、MGL組及LGL組的大鼠大腦皮質中HMGB1表達水平顯著降低(P<0.01)，HGL組及MGL組更為明顯地減低了HMGB1表達水平，但此兩組之間比較無顯著統計學差異(P>0.05)(見圖3)。

C：正常對照組；SE+S:生理鹽水組；LGL：低劑量組；MGL：中劑量組；HGL：高劑量組。HGL組、MGL組和LGL組與SE+S組之間正常神經元密度比較。與SE+S組相比，HGL組和MGL組正常神經元密度增多尤為顯著((###P<0.001,##P<0.01)，但HGL組和MGL組之間比較無統計學差異(ns)

圖1 各組大鼠腦組織尼氏染色(×40)及神經元密度的比較

SE+S：生理鹽水組；LGL：低劑量組；MGL：中劑量組；HGL：高劑量組。與SE+S組相比，HGL組、MGL組和LGL組中大鼠血清中HMGB1表達水平明顯減低(#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001)

圖2 ELISA檢測大鼠血清中HMGB1的表達情況

C：正常對照組；SE+S：生理鹽水組；LGL：低劑量組；MGL：中劑量組；HGL：高劑量組。與C組相比，SE+S組大鼠大腦皮質中HMGB1表達水平顯著升高；與SE+S組相比，HGL組、MGL組和LGL組中大鼠大腦皮質中HMGB1表達水平明顯減低(##P<0.01,###P<0.001)；與LGL組相比，HGL組和MGL組 HMGB1表達水平降低更為顯著(**P<0.01)，但HGL組和MGL組之間HMGB1表達無統計學差異(ns)

圖3 Western blot檢測大鼠大腦皮質HMGB1的表達情況

3 討 論

癲癇是中樞神經系統的常見病和多發病，癲癇持續狀態(status epilepticus,SE)更是神經系統的急重癥，具有極高致死率和致殘率，嚴重影響著患者及家屬的生活質量。目前對于癲癇發病相關病理生理機制的闡述和涉及的治療手段眾多，如藥物、神經刺激及外科手術等。然而，傳統的藥物及手術等常受到毒副作用及并發癥等影響，臨床治療效果并不理想[1]，因此，探索新的SE后神經保護藥物及相關作用機制仍顯得刻不容緩。

大量研究表明腦內炎癥反應與癲癇緊密相關，特別是腦損傷或癲癇發作可以激活小膠質細胞和星形膠質細胞釋放促炎介質，從而啟動級聯的腦組織的炎癥過程[9]。動物實驗表明許多炎癥介質如細胞因子、補體、前列腺素等都參與了癲癇發生過程，抑制炎癥因子及其受體的干預措施可以減少癲癇發生的頻率、嚴重程度及病理損害[10～12]。臨床研究資料發現在難治性顳葉癲癇及腦發育異常相關癲癇患者的腦組織中存在顯著的炎癥反應[13]。HMGB1作為炎癥因子和炎性趨化因子，廣泛表達于多種組織細胞，能參與調節基因轉錄、穩固胞核結構，且釋放后具有炎癥介質功能[14]。近年來有研究證實在腦卒中和蛛網膜下腔出血患者血漿或腦脊液中HMGB1升高的現象，認為HMGB1可以作為評價神經功能損傷和預后的一個可靠指標。GL作為HMGB1的特異性抑制劑，近幾年國內外有關GL的神經保護作用的研究更是不斷增多。新近研究證實GL可以通過抑制HMGB1減少大鼠腦出血引起的腦損傷以及缺血再灌注引起的肝損傷[15]，GL在大鼠大腦中動脈阻塞導致的腦缺血模型中也發揮了明顯的神經保護作用，其作用機制為通過抑制HMGB1磷酸化，阻斷HMGB1的分泌從而減輕炎癥反應[2]。但HMGB1在SE中的作用機制以及GL在SE后的神經保護作用仍鮮有報道。

本次研究通過建立氯化鋰-匹羅卡品誘導大鼠癲癇模型，結合前期實驗我們發現SE后24 h時神經元損傷最重，因此選擇在大鼠SE后24 h時通過尼氏染色法檢測各組大鼠大腦皮質神經元的損傷程度，采用ELISA及Western blot檢測大鼠血清中及大腦皮質HMGB1的表達變化。結果顯示在SE后24 h大鼠大腦皮質神經元明顯受損，大腦皮質正常神經元數目減少，血清及腦組織中HMGB1的表達明顯上調，而經大鼠尾靜脈給予GL干預后，大腦皮質神經元損傷明顯減輕，大鼠血清及大腦皮質中HMGB1的表達下調，特別是血清中HMGB1的下降與GL給藥量呈明顯劑量依賴性，與LGL組相比，HGL組和MGL組在SE后24 h對大鼠血清及大腦皮質中HMGB1的抑制作用更為明顯，對大腦皮質神經元損傷的保護作用也更為有效，但在抑制皮質HMGB1表達時,HGL組和MGL組兩組間比較沒有明顯統計學差異。

本次研究結果表明尾靜脈給予GL可以有效地減輕SE后大鼠大腦皮質神經元損傷，發揮神經保護作用。其作用機制可能與GL抑制腦組織及血清中HMGB1的表達有關，SE后HMGB1表達可能參與SE后神經細胞炎性壞死的病理過程，而GL通過抑制HMGB1的表達從而對大鼠SE后神經損傷起到保護作用。

[1]Perucca P,O’Brien TJ.Epilepsy in 2014.Novel and large collaborations drive advances in epilepsy[J].Nature Reviews Neurology,2015,11(2):74-76.

[2]Kim SW,Jin Y,Shin JH,et al.Glycyrrhizic acid affords robust neuroprotection in the postischemic brain via anti-inflammatory effect by inhibiting HMGB1 phosphorylation and secretion[J].Neurobiology of Disease,2012,46(1):147-156.

[3]Sun Q,Wang F,Li W,et al.Glycyrrhizic acid confers neuroprotection after subarachnoid hemorrhage via inhibition of high mobility group box-1 protein:a hypothesis for novel therapy of subarachnoid hemorrhage[J].Medical Hypotheses,2013,81(4):681-685.

[4]Luo L,Jin Y,Kim ID,et al.Glycyrrhizin attenuates kainic acid-induced neuronal cell death in the mouse hippocampus[J].Experimental Neurobiology,2013,22(2):107-115.

[5]Zhang J,Wu Y,Weng Z,et al.Glycyrrhizin protects brain against ischemia-reperfusion injury in mice through HMGB1-TLR4-IL-17A signaling pathway[J].Brain Research,2014,1582:176-186.

[6]Ohnishi M,Katsuki H,Fukutomi C,et al.HMGB1 inhibitor glycyrrhizin attenuates intracerebral hemorrhage-induced injury in rats[J].Neuropharmacology,2011,61(5-6):975-980.

[7]Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.II.Motor seizure[J].Electroencephalography and Clinical Neurophysiology,1972,32(3):281-294.

[8]Costa-Ferro ZS,Vitola AS,Pedroso MF,et al.Prevention of seizures and reorganization of hippocampal functions by transplantation of bone marrow cells in the acute phase of experimental epilepsy[J].Seizure,2010,19(2):84-92.

[9]Vezzani A,French J,Bartfai T,et al.The role of inflammation in epilepsy[J].Nature Reviews Neurology,2011,7(1):31-40.

[10]Walker L,Sills GJ.Inflammation and epilepsy:the foundations for a new therapeutic approach in epilepsy[J].Epilepsy Currents/American Epilepsy Society,2012,12(1):8-12.

[11]Glass CK,Saijo K,Winner B,et al.Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration[J].Cell,2010,140(6):918-934.

[12]Li Z,Li B,Zhu X,et al.Neuroprotective effects of anti-high-mobility group box 1 antibody in juvenile rat hippocampus after kainic acid-induced status epilepticus[J].Neuroreport,2013,24(14):785-790.

[13]Feldmann M,Asselin MC,Liu J,et al.P-glycoprotein expression and function in patients with temporal lobe epilepsy:a case-control study[J].The Lancet Neurology,2013,12(8):777-785.

[14]Fang P,Schachner M,Shen YQ.HMGB1 in development and diseases of the central nervous system[J].Molecular Neurobiology,2012,45(3):499-506.

[15]Ogiku M,Kono H,Hara M,et al.Glycyrrhizin prevents liver injury by inhibition of high-mobility group box 1 production by Kupffer cells after ischemia-reperfusion in rats[J].The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2011,339(1):93-98.

Protectiveeffectsandmechanismofglycyrrhizinonstatusepilepticusrats

WANGLin,LIYajun,ZHANGBei,etal.

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China)

ObjectiveTo study the protective effects and mechanism of glycyrrhizin on neuronal damage of Status Epilepticus (SE) rat hippocampus.Methods60 healthy adult male Sprague-Dawley rats were included in this study.SE rat model were induced by intraperitoneally injected with lithium and pilocarpine method.All rats were randomly divided into three groups:(SE+GL)-treated group,(SE+S) group and normal control group.According to different GL dosage,(SE+GL)-treated group were divided into three subgroup:high glycyrrhizin group (HGL,20 mg/kg),middle glycyrrhizin group (MGL,10 mg/kg),low glycyrrhizin group (LGL,5 mg/kg).The hippocampal neuronal damage was detected by nissl’s staining,levels of HMGB1 in serum and hippocampus were determined with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and western blot.ResultsCompared with those in (SE+S) group,the cortical neurons damage significantly reduced and HMGB1 expressions were significantly decreased in (SE+GL)-treated group (P<0.05).ConclusionGL significantly decreased neuronal damage in the cortex of SE rat models,and it turned out dose-dependent.These results suggest that GL affords neuroprotective effects in lithium-pilocarpine induced SE rats,which may via inhibiting the expressions of HMGB1 in serum and cortical neurons.

Status epilepticus； Glycyrrhizin； Cortical neuron； HMGB1

R742.1

A

1003-2754(2017)10-0893-04

2017-06-12；

2017-09-28

陜西省科技統籌創新工程計劃(No.S2015TLSF0010);陜西省教育廳基金(No.11JK0715);陜西省衛生廳科研基金(No.2012D43)

(1.寧夏醫科大學臨床醫學院，寧夏 銀川 750003；2.西安醫學院第一附屬醫院神經內科，陜西 西安 710077；3.西安市中心醫院神經內科，陜西 西安 710021)

李亞軍，E-mail：liyajun9@hotmail.com