microRNA-181c在重癥肌無力患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及其意義

郭明鳳， 陳 政， 趙紅梅， 董瑞國， 張 勇， 孫 虹

microRNA-181c在重癥肌無力患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及其意義

郭明鳳1， 陳 政1， 趙紅梅1， 董瑞國2， 張 勇2， 孫 虹1

目的探討microRNA-181c(miR-181c)在重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)患者中的表達(dá)水平及其臨床意義。方法收集2015年6月-2017年6月收治的22例MG患者和20例健康人的外周靜脈血樣，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中總RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測PBMC中miR-181c的相對表達(dá)水平，并分析miR-181c表達(dá)水平與患者的MG定量評分體系(quantitative myasthenia gravis score，QMG)的相關(guān)性。結(jié)果MG患者PBMC中miR-181c的相對表達(dá)水平(0.303±0.150)較對照組(1.000±0.262)顯著降低(P<0.01)，其中全身型患者(0.182±0.056)低于眼肌型患者(0.404±0.126)(P<0.05)，同時(shí)miR-181c表達(dá)水平與QMG呈負(fù)相關(guān)(R2=-0.359，P<0.05)。結(jié)論MG患者PBMC中miR-181c表達(dá)水平的降低可能與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。

重癥肌無力； 人外周血單個(gè)核細(xì)胞； miR-181c

MG是一種由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與、累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜、引起神經(jīng)肌肉接頭傳遞障礙、出現(xiàn)骨骼肌收縮無力的獲得性自身免疫性疾病。MG主要臨床表現(xiàn)為骨骼肌無力、易疲勞、活動(dòng)后加重，休息和應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑后癥狀明顯緩解[1]。但其確切發(fā)病機(jī)制目前仍尚不明確。microRNA作為廣泛存在于生物體內(nèi)的高度保守的短小RNA，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及免疫、炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[2～4]。近年來關(guān)于miR-181c的研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及自身免疫性疾病中可能起到關(guān)鍵作用[5～7]。因此我們以miR-181c為研究對象，通過檢測其在MG患者PBMC中的相對表達(dá)水平來探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 收集2015年6月-2017年6月南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院收治的22例MG患者(包括眼肌型12例，全身型10例)，同時(shí)以20例健康體檢者作為對照組。實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)臨床癥狀、疲勞試驗(yàn)、新斯的明試驗(yàn)、神經(jīng)電生理檢查或相關(guān)血清抗體的檢測確診為重癥肌無力的患者，且就診前3 m內(nèi)未使用過激素或免疫抑制劑；不伴其他自身免疫性或炎性疾病；女性患者處于非妊娠、非哺乳期。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：體檢各項(xiàng)指標(biāo)正常；3 m內(nèi)未使用過激素或免疫抑制劑，無自身免疫性或炎性疾病的健康人。根據(jù)患者癥狀采用QMG評分表分別進(jìn)行評分。分別對兩組(MG組與健康對照組；眼肌型與全身型)年齡進(jìn)行t檢驗(yàn)、性別構(gòu)成比進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，兩組研究對象在年齡、性別構(gòu)成比方面均無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

1.1.2 主要試劑及儀器 淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破饭?；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；SYBR Green Realtime RT 試劑盒、SYBR Green Realtime PCR試劑盒(上海艾博思生物科技有限公司)；Roche LightCycler 480 PCR儀(羅氏公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及cDNA提取 所有受試者空腹采血，采用Ficoll分層液法分離得到PBMC，Trizol 法提取PMBC中總RNA，進(jìn)行RNA純度及完整性測定(見圖1)。以上述RNA為模板制備cDNA，所得cDNA-20 ℃保存作為PCR反應(yīng)模板。

1.2.2 檢測PBMC中miR-181c的相對表達(dá)水平 以cDNA為模板，按說明書建立PCR反應(yīng)體系后上PCR儀器檢測，PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)定：95 ℃，預(yù)變性，3min；變性，95 ℃，15 s；退火延伸，60 ℃，40 s；共45個(gè)循環(huán)，作融解曲線及擴(kuò)增曲線(見圖2、圖3)驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，反應(yīng)完成后設(shè)定基線值(Baseline)和閾值(Threshold)，讀取閾循環(huán)(Ct)值。根據(jù)公式[8]ΔCt =[Ct (目的基因miR-181c )]-[Ct (內(nèi)參基因U6)]和ΔΔ Ct =[ Δ Ct (研究組)]-[ Δ Ct (對照組)]，計(jì)算出相對表達(dá)量 =2 -ΔΔCt 。

2 結(jié) 果

2.1 研究發(fā)現(xiàn) MG組PBMC中miR-181c的相對表達(dá)水平(0.303±0.150)顯著低于健康對照組(1.000±0.262)(見圖4A)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(★★P<0.01)，其中全身型亞組表達(dá)水平(0.182±0.056)低于眼肌型亞組(0.404±0.126)(見圖4B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(▲P<0.05)。

2.2 在研究重癥肌無力組PBMC中miR-181c的表達(dá)量與患者的QMG相關(guān)性顯示 MG組的表達(dá)水平與QMG呈負(fù)相關(guān)性，R2=-0.359，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖5)。

表1 重癥肌無力組患者與健康對照組一般資料比較

圖1 RNA電泳條帶圖

圖2 miR-181c 溶解曲線及擴(kuò)增曲線

圖3 U6溶解曲線及擴(kuò)增曲線

圖4 MG組與健康對照組PBMC中miR-181c的表達(dá)水平(A)；眼肌型亞組與全身型亞組PBMC中miR-181c的表達(dá)水平(B)(★★P<0.01，▲P<0.05)

miR-181c相對表達(dá)量

圖5 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-181c相對表達(dá)量與QMG呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)

3 討 論

microRNA在控制和調(diào)節(jié)免疫方面的研究已日漸增多，近期有研究報(bào)道[9]，對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)模型大鼠外周血淋巴細(xì)胞差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有11個(gè)miRNAs 表達(dá)差異顯著：其中8 個(gè)miRNAs 表達(dá)下調(diào)(miR-24、miR-151、miR-423、miR-181c、miR-145、miR-326、miR-143和miR-328a)；3 個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)(miR-101a、miR-193和miR-33)，而miR-181c就是其中表達(dá)的下調(diào)基因。

miR-181c作為miR-181家族成員，位于第19號染色體正鏈，其基因組結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上非常保守，含有共同的5’端“種子”序列-ACAUUCA。Xue等[10]報(bào)道了在原始T細(xì)胞和活化CD4+T細(xì)胞中篩選鑒定差異表達(dá)的miRNAs時(shí)，發(fā)現(xiàn)miR-181c 有調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞活化的潛力，進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-181c 表達(dá)水平在T細(xì)胞活化過程中降低，轉(zhuǎn)染miR-181c模擬物可以部分抑制T細(xì)胞的活化，從而證實(shí)了miR-181c對CD4+T細(xì)胞的負(fù)調(diào)控作用。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-181c在多種腫瘤中表達(dá)異常，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、胰腺癌等。He[11]等發(fā)現(xiàn)可以通過miR-181c過表達(dá)，下調(diào)TGFBR1、TGFBR2和TGFBRAP1表達(dá)水平，抑制TGF-β信號傳導(dǎo)，從而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲、遷移和間質(zhì)轉(zhuǎn)化中起到關(guān)鍵作用。Yao[12]等研究報(bào)道m(xù)iR-181c通過與3’-UTR結(jié)合靶向調(diào)節(jié)PRKCD的表達(dá)，從而使A2780細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移減少，來抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。Chen[13]等研究發(fā)現(xiàn)miR-181c可以直接抑制人胰腺癌細(xì)胞中的MST、LATS2、MOB1和SAV1的表達(dá)；miR-181c的過度表達(dá)誘導(dǎo)YAP/TAZ的高活化并增強(qiáng)Hippo信號傳導(dǎo)下游基因CTGF，BIRC5和BLC2L1的表達(dá)，導(dǎo)致體外和體內(nèi)胰腺癌細(xì)胞存活和化學(xué)耐藥的發(fā)生。

目前miR-181c在自身免疫性疾病中的報(bào)道較為少見。Haghikia 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化患者(relapsing-remitting MS，RRMS)相比，繼發(fā)進(jìn)展型多發(fā)性硬化患者(secondary progressive MS，SPMS)腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中miR-181c表達(dá)水平降低。Abdelsadik A[14]的研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體(TLR)這一類受體家族，其通過宿主的先天免疫系統(tǒng)識別入侵病原體的存在，而不恰當(dāng)?shù)腡LR信號傳導(dǎo)可導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生。而另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-181c-TLR4通路在缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)元激活中起到重要作用，miR-181c通過與其3’-UTR結(jié)合抑制TLR4的表達(dá)，從而抑制NF-κB的活化和下游促炎性介質(zhì)的產(chǎn)生[15]。上述研究均提示miR-181c可能在神經(jīng)免疫疾病中具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)MG患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-181c的相對表達(dá)水平顯著低于對照組，且全身型低于眼肌型。同時(shí)miR-181c的表達(dá)水平與QMG呈負(fù)相關(guān)，提示其表達(dá)水平的降低可能與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。由于本研究時(shí)間有限，收集病例數(shù)相對較少，還需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步深入探究miR-181c在MG中具體可能的作用機(jī)制。

[1]中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會神經(jīng)免疫學(xué)組，中國免疫學(xué)會神經(jīng)免疫學(xué)分會.中國重癥肌無力診斷和治療指南2015[J].中華神經(jīng)科雜志，2015，48(11)：934-940.

[2]Geisler A，F(xiàn)echner H．MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy[J].World J Exp Med，2016，6(2)：37-54.

[3]Araldi E，Chamorro JA，Van SC，et al．Therapeutic potential of modulating microRNAs in atherosclerotic vascular disease[J].Curr Vasc Pharmacol，2015，13(3)：291-304.

[4]Qiu L,Tan EK,Zeng L.microRNAs and Neurodegenerative diseases[J]．Adv Exp Med Biol，2015，888(6)：85-105.

[5]Cui MH， Hou XL，Lei XY，et al.Upregulation of microRNA 181c expression in gastric cancer tissues and plasma[J].Asian Pac J Cancer Prev，2013，14(5)：3063-3066.

[6]Xu Z，Jiang J，Xu C，et al.MicroRNA-181 Regulates CARM1 and histone arginine methylation to promote differentiation of human embryonic stem cells[J].PLoS One，2013，8(1)：e53146.

[7]Haghikia A，Haghikia A，Hhllwig K，et al.Regulated microRNAs in the CSF of patients with multiple sclerosis：a case-control study[J].NLM，2012，7(9)：2166-2170.

[8]Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Delta Delta C(T) Method[J].Methods，2001，25(4)：402-408.

[9]Wang J，Zheng S，Xin N，et al.Identification of novel MicroRNA signatures linked to experimental autoimmune myasthenia gravis pathogenesis：down-regulated miR-145 promotes pathogenetic Th17 cell response[J].J Neuroimmune Pharm，2013，8(5)：1287-1302.

[10]Xue Q，Guo ZY，Li W，et al.Human activated CD4+T lymphocytes increase IL-2 expression by downregulating microRNA-181c[J].Mol Immunol，2011，48(4)：592-599.

[11]He X，Liu Z，Peng Y，et al.MicroRNA-181c inhibits glioblastoma cell invasion,migration and mesenchymal transition by targeting TGF-β pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2016，469(4)：1041-1048.

[12]Yao L，Wang L，Li F，et al.MiR181c inhibits ovarian cancer metastasis and progression by targeting PRKCD expression [J].Int J Exp Med，2015，8(9)：15198-15205.

[13]Chen M，Wang M，Xu S，et al.Upregulation of miR-181c contributes to chemoresistance in pancreatic cancer by inactivating the Hippo signaling pathway [J].Oncotarget，2015，6(42)：44466-44479.

[14]Abdelsadik A，Trad A.Toll-like receptors on the fork roads between innate and adaptive immunity[J].Hum Immunol，2011，72(12)：1188-1193.

[15]Zhang L，Li YJ，Wu XY，et al.MicroRNA-181c negatively regulates the inflammatory response in oxygen-glucose-deprived microglia by targeting Toll-like receptor 4[J].J Neurochem,2015,132(6)：713-723.

ExpressionofmicroRNA-181cinperipheralbloodmononuclearcellsfrompatientswithmyastheniagravisanditssignificance

GUOMingfeng,CHENZheng,ZHAOHongmei,etal.

(DepartmentofEmergencyMedicine，Huai’anFirstPeople’sHospital，NanjingMedicalUniversity，Huai’an223300,China)

ObjectiveTo evaluate the expression and clinical significance of miR-181c in patients with myasthenia gravis.MethodsPlasma blood samples from 22 patients with MG and 20 healthy subjects were collected from June 2015 to June 2017，and the total RNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells.To detect the relative expression of miR-181c in PBMC by Real-time quantitative polymerase chain reaction and to analyze the correlation between the expression level of miR-181c and the quantitative myasthenia gravis score (QMG) in MG patients.ResultsThe relative expression level of miR-181c in PBMC of MG patients (0.303±0.150) was significantly lower than that of control group (1.000±0.262) (P<0.01),and the level of miR-181c in generalized patients (0.182±0.056) was lower than that in ocular patients (0.404±0.126) (P<0.05),meanwhile the expression level of miR-181c was negatively correlated with QMG (R2=-0.359，P<0.05).ConclusionThe decrease of miR-181c expression in PBMC of MG patients may be related to the severity of the disease.

Myasthenia gravis； PBMC； miR-181c

R746.1

A

1003-2754(2017)10-0916-03

2017-08-12；

2017-10-03

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院急診科，江蘇 淮安 223300；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 徐州 221000)

孫 虹，E-mail：hayyzb@126.com