阿魏酸對戊四氮致癲癇大鼠海馬組織中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

邢玉鳳， 劉東海， 張淑紅， 張玉萍， 朱金玲

阿魏酸對戊四氮致癲癇大鼠海馬組織中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

邢玉鳳， 劉東海， 張淑紅， 張玉萍， 朱金玲

目的探討阿魏酸(Ferulic acid,FA)對戊四氮致癲癇大鼠海馬組織中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響,近而討論FA對戊四氮致癲癇鼠海馬神經元的保護作用。方法將60只雄性健康的Wister大鼠隨機分為生理鹽水組、模型組(PTZ 35 mg/kg)和阿魏酸干預組(50 mg/kg)，均采用腹腔注射的方式，連續注射28 d，停止給藥1 d后處死實驗大鼠、取材。應用免疫組織化學技術和Western blot方法來檢測Bax和Bcl-2的表達情況，用來判斷癲癇所導致的細胞凋亡情況。結果阿魏酸干預組大鼠的海馬組織Bax的表達量明顯低于模型組，差異有顯著性(P<0.01)，Bcl-2的表達量高于模型組，差異有顯著性(P<0.01)；生理鹽水組大鼠的海馬組織內Bax的表達量明顯低于模型組，差異有顯著性(P<0.01)，Bcl-2表達量明顯高于模型組，差異有顯著性(P<0.01)。結論阿魏酸對戊四氮致癲癇大鼠海馬神經元損傷具有保護作用，其保護作用機制可能與其抑制鼠腦細胞凋亡有關。

阿魏酸； 癲癇； 戊四氮； Bax； Bcl-2

癲癇是一種常見的神經系統疾病，我國癲癇發病率在3.5%～4.8%[1]。其病理表現為大腦神經元反復異常放電導致的大腦功能失調。癲癇的發生與神經元的凋亡、神經元的興奮性增加及突觸的異常等相關[2]。癲癇異常放電導致神經細胞毒性損傷可能導致神經元的凋亡。阿魏酸對脂多糖損傷大鼠海馬神經元細胞的保護作用已被證實[3]，阿魏酸在治療心腦血管疾病中具有很好的耐藥性，但目前沒有人去探討其對癲癇的影響,因此我們選擇阿魏酸來探討其對戊四氮致癲癇大鼠神經元的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 Rabbit Anti Bax，Rabbit Anti Bcl-2，Mouse Anti β-actin，Goat Anti-Mouse IgG，Goat Anti-Rabbit IgG，考馬斯亮藍染色液，考馬斯亮藍脫色液，5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)，SDS(武漢博士德生物工程有限公司)。彩虹245廣譜蛋白Marker，PMSF(100 mmol)，10×電泳液，10×轉膜液，20×TBS(北京索萊寶科技有限公司)。BCA試劑盒，ECL化學發光液(上海碧云天生物技術有限公司)。兔SP檢測試劑盒，DAB 試劑盒(北京中衫金橋生物技術有限公司)。戊四氮(Sigma公司)，阿魏酸(上海源葉生物科技有限公司)其他試劑均由分子實驗室提供。

1.2 分組和模型的建立 選擇30只體重在(200±20)g之間健康雄性Wistar大鼠(佳木斯大學動物實驗中心提供),采用隨機數字表法將其平均分為3組：生理鹽水組、模型組(PTZ)、阿魏酸(PTZ+FA)干預組，每組10只。每天12點將戊四氮(35 mg/kg)和生理鹽水腹腔注射大鼠體內，在注射PTZ前20 min注射阿魏酸(50 mg/kg)，連續注射28 d，最后一次給藥24 h后，用10%的水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，用隨機數字表法將每組大鼠隨機分為兩組，一組采用心臟灌注固定取腦，左右大腦半球置于10%甲醛中固定，待用于免疫組化檢測；另一組斷頭取海馬區置于液氮中保存，待用于Western blot法檢測Bax和Bcl-2蛋白。

1.3 免疫組化SP法檢測大鼠海馬內Bax和Bcl-2蛋白的表達 從10%的中性甲醛中取出固定好的腦組織，取視交叉后4～5 mm即海馬平面。石蠟脫水，石蠟包埋，切片(5 μm)，烤片(56 ℃，24 h)，石蠟切片經二甲苯及梯度酒精脫蠟后用枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)水浴97 ℃20 min。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。37 ℃3%H2O2去離子水孵育15 min。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。37 ℃山羊血清封閉20 min，吸去封閉液滴加一抗(Bax、Bcl-2 1∶200)37 ℃孵育2 h。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液37 ℃孵育20 min。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育15 min。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。DAB顯色，顯微鏡下控制時間。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。蘇木精復染30 s、返藍10 min。常規脫水透明，中性樹脂封片，顯微鏡拍照并觀察海馬CA1區陽性細胞。用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對圖片進行平均光密度分析。

1.4 Western blot方法檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達 從液氮中取出海馬組織，放入2 ml的EP管中倒入磁珠和Western細胞裂解液，用組織研磨機將組織碾碎致勻漿，4 ℃靜置30 min后，4 ℃ 12000 rpm 離心10 min，取上清液。用BCA試劑盒測蛋白的濃度，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液55 ℃水浴10 min，恢復室溫。凝膠:下層膠采用15%的分離膠(10 ml)；上層膠采用5%的壓縮膠(3 ml)。電泳：上層壓縮膠恒壓70 V；下層分離膠恒壓120 V，至膠板最下端1 cm處停止。并按照Marker和目的蛋白的分子量來切膠。轉膜：將PVDF膜裁剪合適的大小，甲醇浸潤20 s，用電轉液將纖維層和濾紙浸濕。按照陰極-纖維層-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-纖維層-陽極順序制作“三明治”，用電壓100 V、電流200 mA進行電轉。37 ℃ 5%脫脂奶粉(TBS溶解)封閉1.5 h。一抗孵育4 ℃過夜(β-actin 1∶1000，Bax 1∶200，Bcl-2 1∶200)。TBST 5 min/遍，洗3遍。二抗室溫孵育1 h(HRP標記山羊抗小鼠IgG 1∶1000)。TBST 5 min/遍，洗3遍，ECL曝光。使用天能GLS拍照并進行圖像分析，計算目的條帶與內參條帶的光密度值比。

2 結 果

2.1 免疫組化SP法檢測的大鼠海馬內Bax和Bcl-2蛋白的表達水平 Bax、Bcl-2蛋白免疫反應表現為棕色或棕黃色定位于細胞胞漿內,結果(見圖1、圖2)。阿魏酸干預組大鼠的海馬組織Bax的表達量明顯低于模型組(P<0.01)，生理鹽水組Bax的表達量明顯低于模型組(P<0.01)(見圖1);阿魏酸干預組大鼠的海馬組織bcl-2的表達量明顯高于模型組(P<0.01),生理鹽水組大鼠的海馬組織內Bcl-2明顯高于模型組(P<0.01)(見圖2)。

2.2 Western blot方法檢測的Bax和Bcl-2蛋白的表達水平 阿魏酸干預組大鼠的海馬組織Bax的表達量明顯低于模型組(P<0.01)，生理鹽水組Bax的表達量明顯低于模型組(P<0.01)；阿魏酸干預組大鼠的海馬組織Bcl-2的表達量明顯高于模型組(P<0.01),生理鹽水組大鼠的海馬組織內Bcl-2明顯高于模型組(P<0.01)(見圖3)。

圖1A 是生理鹽水組(NS)，模型組(PTZ),阿魏酸干預組(PTZ+FA)海馬CA1區免疫組化圖片(×200);圖1B 各組大鼠海馬CA1區神經元細胞Bax平均光密度(生理鹽水組、阿魏酸干預組分別和模型組相比P<0.01)

圖1 大鼠海馬CA1區細胞Bax蛋白的表達

圖2A 是生理鹽水組(NS)，模型組(PTZ),阿魏酸干預組(PTZ+FA)海馬CA1區免疫組化圖片(×200);圖2B 各組大鼠海馬CA1區神經元細胞Bcl-2平均光密度(生理鹽水組、阿魏酸干預組分別和模型組相比P<0.01)

圖2 大鼠海馬CA1區細胞內Bcl-2蛋白的表達

圖3 Western blot方法檢測的大鼠海馬CA1區細胞內Bax和Bcl-2蛋白表達水平

3 討 論

癲癇是慢性反復發作性短暫腦功能失調綜合征,以腦神經元異常放電引起反復癇性發作為特征。癲癇是神經系統常見疾病之一,在我國的發病率在3.5%～4.8%,嚴重影響了人類健康。目前苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平、丙戊酸鈉是廣泛應用的一線抗癲癇藥，但30%患者出現耐藥性，為此尋找新的抗癲癇藥物，研究癲癇的發病機制成為人們研究的熱點。

戊四氮點燃大鼠慢性癲癇模型與人類癲癇發作十分相似，有病理反應的局灶部位的確定性、病理反應的漸進性、效應的穩定性和持久性等優點；且戊四氮本身不具有神經毒性，不會直接造成神經元的凋亡[4]。是理想的癲癇動物模型。目前廣泛應用于抗癲癇新藥的實驗研究中。為此我們選用戊四氮誘導的癲癇模型鼠，研究阿魏酸對癲癇大鼠的腦的保護作用，及其可能的發生機制。

阿魏酸(FA)是廣泛使用的藥材的重要組成部分，屬于羥基肉桂酸家族。FA在許多植物的葉子和種子中高度豐富，特別是在糙米、全麥和燕麥等谷物中，已被認為具有許多藥理學性質，包括神經元祖細胞增殖、抗炎、抗氧化和神經保護活性[5,6]。許多實驗研究報道了FA的神經保護作用，包括腦損傷、脊髓缺血和阿爾茨海默氏病[7～9]，但目前沒有人應用阿魏酸對癲癇進行研究腦保護作用及機制進行研究，目前已有研究證實阿魏酸具有抗細胞凋亡作用[10～12]，而癲癇導致的神經元損傷會引起細胞凋亡，我們推測阿魏酸可以抑制細胞凋亡保護癲癇導致的神經元損傷。因此我們選擇阿魏酸來探討其對戊四氮致癲癇大鼠腦海馬區的神經元細胞內凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達的影響。

B淋巴細胞瘤-2基因簡稱Bcl-2,是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一。Bcl-2蛋白家族是一個特別的家族，其成員中有些促進凋亡，如Bad、Bid、Bax，有些成員阻止細胞凋亡,如Bcl-2、 Bcl-x、Bcl-w。其中Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，如果Bax相對量高于Bcl-2，則Bax同二聚體的數量增多，從而促進細胞死亡；而如果Bcl-2相對量高于Bax，則促進形成Bcl-2/Bax異二聚體，并使Bcl-2同二聚體的量增多，從而抑制細胞凋亡。我們的研究結果顯示：阿魏酸干預組大鼠的海馬組織CA1區的Bax蛋白的表達量明顯低于模型組;相反Bcl-2的表達量高于模型組;生理鹽水組大鼠的海馬組織內Bcl-2明顯高于模型組;Bax的表達量明顯低于模型組，說明阿魏酸可促進Bcl-表達，降低Bax表達，從而抑制細胞凋亡。阿魏酸可減少戊四氮致癲癇鼠的癲癇發作強度和頻率以及癲癇發作時間。阿魏酸對大鼠海馬神經元具有保護作用，抗凋亡可能是其作用的機制之一。

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EffectsofferulicacidontheexpressionofBaxandBcl-2proteininhippocampusofpentylenetetrazole-inducedepilepsyrats

XINGYufeng,LIUDonghai,ZHANGShuhong,etal.

(SchoolofBasicMedicalSciencesofJiamusiUniversity,Jiamusi154007,China)

ObjectiveTo investigate the effect of ferulic acid (FA) on the expression of Bax and Bcl-2 protein in hippocampus of pentylenetetrazole (PTZ)-induced epilepsy rats,and to discuss the protective effect of FA on hippocampal neurons in pentylenetetrazol-induced epilepsy effect.Methods60 male healthy wister rats were randomly divided into saline group，model group (PTZ 35 mg/kg) and ferulic acid intervention group (50 mg/kg).The rats were injected intraperitoneally with continuous 28 days,the rats were sacrificed after one day.Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of Bax and Bcl-2,which were used to determine the apoptosis induced by epilepsy.ResultsThe expression of Bax in the hippocampus was significantly lower than that in the model group (P<0.01).The expression of Bcl-2 was significantly higher than that of the model group (P<0.01).ConclusionFerulic acid has protective effect on hippocampal neuronal injury induced by pentylenetetrazole in epilepsy rats,and its protective mechanism may be related to its inhibition of brain cell apoptosis.

Ferulic acid; Epilepsy; Pentylenetetrazole; Bax； Bcl-2

R742.1

A

1003-2754(2017)10-0919-03

2017-08-20；

2017-10-04

佳木斯大學創新團隊項目資助(No.CXTDPY-201602)

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

通迅作者：朱金玲，E-mail:370786436@qq.com