先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病一家系及PNPLA1基因突變分析

趙惠娟 閆慧敏 郭獨一 朱培秋 雷鵬程 路雪艷 姜薇100191北京大學第三醫院皮膚科

先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病一家系及PNPLA1基因突變分析

趙惠娟 閆慧敏 郭獨一 朱培秋 雷鵬程 路雪艷 姜薇100191北京大學第三醫院皮膚科

目的鑒定一先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病家系的致病基因，并探討基因型與表型的關系。方法外周血中提取先證者及其哥、父母DNA，用全基因組外顯子測序明確先證者的突變位點，根據突變位點設計特異性引物，用PCR來檢測突變位點從而進一步確定該家系的致病原因。結果發現先證者PNPLA1基因的一條等位基因第4號外顯子上700位的胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代（c.700C＞T），導致了脯氨酸變成了絲氨酸（p.pro234ser），先證者哥也檢測到相同突變；父母均為該突變基因的攜帶者，該突變在健康對照者中未檢出。結論PNPLA1基因的錯義突變（p.pro234ser）是引起該患者臨床癥狀的特異突變。

遺傳性疾病，先天性；染色體障礙；突變；基因，PNPLA1；先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病

先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病（autosomal recessive congenital ichthyosis，ARCI；OMIM242300）是一種以皮膚干燥、全身脫屑為主要特點的角質形成細胞分化障礙性疾病，有一定的遺傳異質性，可伴有系統損害而出現相應的綜合征。目前已證實該病的致病基因有 9 個：TGM1［1］、ALOX12B［2］、ALOXE3［2］、ABCA12［3］、NIPAL4 （ichthyin）［4］、CYP4F22［5］、CRE53［6］、LIPN3［7］、PNPLA1［8］，其中TGM1突變占34%～55%。PNPLA1基因自2012年首次發現為ARCI致病基因以來，迄今只報道5個家系。我們在臨床中發現一個ARCI家系，在進行基因突變研究時發現，該家系由PNPLA1基因突變所致，進而對其發病的分子基礎與臨床表型之間的關系進行了探討。

資料與方法

一、臨床資料

先證者男（圖1，Ⅳ2），14歲。因全身散在皮疹伴鱗屑14年就診。患兒出生后無明顯誘因全身出現不規則迂曲斑片，暗紅色、覆有鱗屑、漸融合成片、無明顯自覺癥狀，偶伴癢感。其哥（Ⅳ1）15歲，出生時呈火棉膠樣嬰兒表現，隨年齡增長皮疹逐漸減輕。其父母均無類似疾病史，但為近親結婚（Ⅲ1、Ⅲ2），見圖1。先證者皮膚科檢查：面部、前胸、下腹部、雙下肢可見散在迂曲的暗紅色、暗褐色斑上覆有灰白色鱗屑，部分皮損融合成片、鱗屑較厚，皮損部分邊緣微隆起（圖2A）。其哥僅見軀干、四肢皮膚干燥、粗糙，上覆細碎鱗屑（圖2B）。兩患兒毛發、指甲均正常；生長發育正常、智力正常；無瞼外翻、唇外翻、耳聾等畸形。組織病理（取材于先證者及其哥股內側皮膚）可見：①角化過度伴部分區域角化不全；②棘層肥厚；③表皮乳頭瘤樣增生；④真皮淺層血管周圍以淋巴為主的炎癥細胞浸潤（圖2C、2D）。診斷ARCI。2例患者經外用維生素E乳膏，早晚各1次，囑患者洗澡后即刻涂抹保濕潤膚劑，使用3個月后皮損明顯減輕，鱗屑明顯減少。正常對照取材來源于同年齡、同部位切除色素痣男性的正常皮膚。

圖1 先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病家系圖 近親婚配

圖2 先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病患者臨床特點及組織病理 2A：先證者前胸、腹部皮損，可見暗褐色斑片，上覆灰白色鱗屑，部分區域融合成片；2B：先證者哥前胸、腹部皮損，可見前胸部皮膚干燥，上覆細碎鱗屑；2C、2D：先證者（2C）和先證者哥（2D）皮損組織病理 表皮角化過度伴部分區域角化不全，棘層肥厚，表皮乳頭瘤樣增生，真皮淺層血管周圍以淋巴為主的炎癥細胞浸潤（HE×100）

二、提取基因組DNA

收集家系中先證者及其哥、父母及100例健康人靜脈血4 ml，并用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳進行DNA濃度及純度的測定。本研究通過北京大學第三醫院醫學倫理委員會批準，患者和健康人均簽署知情同意書。

三、全基因組外顯子測序

1.合格的DNA樣本送深圳華大基因研究院，用NimbleGen商業化2.1M外顯子序列捕獲芯片進行外顯子組區域的測序。整個樣品制備過程包括雜交文庫制備、芯片雜交洗脫以及雜交后測序文庫制備，通過Illumina測序系統（IlluminaHiSeq 2000測序系統，美國Illumina公司）獲得外顯子序列信息。

2.測序驗證：PNPLA1基因序列來自GenBank（NM_001145717），引物設計采用軟件Primer3，在設計引物時，PNPLA1基因的8個外顯子被分成8個片段，其中擴增4號外顯子合成。引物：PNPLA1正向引物5′?CATGGGCCATTTCGATGTAC?3′，反向引物5′?CCTAGTCCCTGGTACCTTCT?3′，引物由北京天一輝遠測序公司合成。分別對患者、其父母、正常人的DNA進行PCR反應。PCR反應采用25 μl體系，包括2 × mix 12.5 μl，10 ng的引物1 μl，ddH2O 9.5 μl以及100 ng的樣本DNA 2 μl。PCR擴增條件為94℃預變性5 min后進入循環，94℃變性30 s，退火溫度為58℃30 s，72℃延伸30 s，33個循環后72℃延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠（溴化乙錠染色）電泳分析，經酶純化后用ABIPrism377型全自動測序儀測序（北京天一輝遠測序公司）。

3.常染色體隱性遺傳性魚鱗病的臨床表現千差萬別，最常見表現為丑角魚鱗病、板層狀魚鱗病和先天性非大皰性魚鱗病樣紅皮病3種，診斷主要依據出生時或嬰兒期皮損特點（多數出生時為膠樣嬰兒），以及遺傳方式和分子生物學診斷。從臨床表現上該家系先證者的哥哥出生時為膠樣嬰兒，2例患者的皮損表現符合ARCI三種亞型中的先天性非大皰性魚鱗病樣紅皮病的表現；父母均不患病，且為近親婚配；分子生物學檢測證實該家系中的2例患者均為純合突變，正常人100個等位基因驗證并未發現該突變，而父母均為該致病基因PNPLA1（c.700C＞T）的攜帶者。因此明確診斷為ARCI。

圖3 健康人皮膚及先證者皮損透射電鏡（×12 000） 3A：健康人皮膚角質層；3B：先證者皮膚角質層，其中可見異常橢圓形脂滴（箭頭）；3C：健康人的角質包膜；3D：患者的角質包膜，角質包膜不連續（箭頭）

圖4 測序結果及PNPLA1基因、蛋白質結構圖 4A：PCR測序結果，Ⅳ1、Ⅳ2 PNPLA1第700位堿基由C突變為T，父母均為攜帶者，健康人第700位堿基為C；4B：PNPLA1基因結構（上排包含8個外顯子，突變發生在4號外顯子上）及蛋白質結構（下排包含2個結構域），紅色箭頭示該家系突變位點；黑色箭頭示迄今世界上已報道的突變位點

結 果

1.透射電鏡結果：①與正常對照（圖3A、3C）相比，患者角質層數明顯增多，高達40層；②患者皮膚角質層中出現了很多異常的橢圓形的脂滴（圖3B）；③與正常人的皮膚中完整連續的角質包膜相比，患者皮膚電鏡中角質包膜是不連續的（圖3D）。

2.對先證者進行了全基因組外顯子測序，后期進行篩選，最終將致病基因鎖定為PNPLA1基因（NM_001145717），突變位點為4號外顯子上700位的胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代（c.700C＞T），導致了脯氨酸變成了絲氨酸（p.pro234ser）；后經直接測序驗證先證者的哥哥同樣存在相同突變，而父母均為攜帶者，在100例正常人中未發現該突變（圖4）。該突變符合此家系的遺傳方式，對測序結果與基因庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001145717）及Ensemble數據庫（http：//www.ensemble.org/）所公布的序列進行比較，可排除單核苷酸多態性，并排除其他基因存在突變后，由此初步判斷該家系的致病基因為PNPLA1。

討 論

ARCI主要包括3種亞型：花斑型魚鱗 病（harlequin ichthyosis，HI；OMIM 242500）、先天性非大皰性魚鱗病樣紅皮 病（congenital ichthyosiformerythro?derma，CIE；OMIM 242100）及板層狀魚鱗 病（lamellar ichthyosis，LI；OMIM 242300、604777、601277、606545）［9］，不同類型的ARCI臨床表現和嚴重程度迥異，其中HI是最嚴重致死的一種類型。目前已證實，與ARCI發病相關的有9個致病基因，其中相對少見的是CRE53、LIPN和PNPLA1，且目前已知的致病基因與臨床表型尚無明確關系。PNPLA1基因位于6p21.31，自從2012年證實該病與PNPLA1基因突變有關以來［8］，全世界共報道了5個家系，其中4個錯義突變，1個無義突變（圖4B），2個家系來自阿爾及利亞［8］，2個家系來自巴基斯坦［10?11］，還有 1 個家系來自西班牙［12］。PNPLA1基因全長1 599 bp，包括8個外顯子，編碼533個氨基酸的蛋白質，PNPLA1蛋白屬于馬鈴薯糖蛋白家族之一，PNPLA1蛋白有3個結構域（圖4B），馬鈴薯糖蛋白結構域（Patatin區，第16～185位氨基酸）和脯氨酸富集疏水區（Pro_rich區，第326～ 451位氨基酸）［13］，目 前 PNPLA1 的 功 能 尚 不 清 楚［14］，PNPLA1蛋白除了在消化系統、骨髓、脾臟中高表達，在表皮顆粒層等其他組織中也有少量表達［13］。

通過全基因組外顯子及PCR測序，我們發現，PNPLA1基因的錯義突變（c.700C ＞T，p.Pro234Ser）是導致該家系中2例ARCI患者發病的主要原因。通過透射電鏡觀察，我們發現患者皮膚角質層中出現了很多異常的橢圓形脂滴，說明患者的脂質代謝途徑存在異常，而脂類是角質包膜（cornified envelope，CE）不可分割的一部分；與正常人的皮膚中完整連續的CE相比，患者的CE是不連續的，說明患者CE的合成過程存在障礙。正常CE的形成是角質形成細胞正常分化的重要環節，也是皮膚屏障功能的重要組成成分，正常的角質包膜形成過程需要轉谷氨酰胺酶，內披蛋白，兜甲蛋白，脂質等［15］。近年的研究表明，PNPLA1參與甘油磷脂的代謝［8］，甘油磷脂參與角質包膜的合成［16］，因此我們推測，PNPLA1突變導致脂質代謝障礙，影響正常角質包膜合成，影響角質形成細胞正常分化導致ARCI發生。我們的研究為進一步研究ARCI基因型與表型之間的關系提供了資料。

［1］Huber M,Rettler I,Bernasconi K,et al.Mutations of keratinocyte transglutaminase in lamellar ichthyosis［J］.Science,1995,267（5197）:525?528.

［2］Jobard F,Lefèvre C,Karaduman A,et al.Lipoxygenase ?3（ALOXE3）and 12（R）?lipoxygenase（ALOX12B）are mutated in non?bullous congenital ichthyosiformerythroderma（NCIE）linked tochromosome 17p13.1［J］.HumMolGenet,2002,11（1）:107?113.

［3］Lefévre C,Audebert S,Jobard F,et al.Mutations in the transporter ABCA12 are associated with lamellar ichthyosis type 2［J］.Hum Mol Genet,2003,12（18）:2369 ?2378.DOI:10.1093/hmg/ddg235.

［4］Lefèvre C,Bouadjar B,Karaduman A,et al.Mutations in ichthyin a new gene on chromosome 5q33 in a new form of autosomal recessive congenital ichthyosis［J］.Hum Mol Genet,2004,13（20）:2473?2482.DOI:10.1093/hmg/ddh263.

［5］Lefèvre C,Bouadjar B,Ferrand V,et al.Mutations in a new cytochrome P450 gene in lamellar ichthyosis type 3［J］.Hum Mol Genet,2006,15（5）:767?776.DOI:10.1093/hmg/ddi491.

［6］Radner FP,Marrakchi S,Kirchmeier P,et al.Mutations in CERS3 cause autosomal recessive congenital ichthyosis in humans［J］.PLoS Genet,2013,9（6）:e1003536.DOI:10.1371/journal.pgen.1003536.

［7］Israeli S,Khamaysi Z,Fuchs?Telem D,et al.A mutation in LIPN,encoding epidermal lipase N,causes a late?onset form of autosomal?recessive congenital ichthyosis［J］.Am J Hum Genet,2011,88（4）:482?487.DOI:10.1016/j.ajhg.2011.02.011.

［8］Grall A,Guaguère E,Planchais S,et al.PNPLA1 mutations cause autosomal recessive congenital ichthyosis in golden retriever dogs and humans［J］.Nat Genet,2012,44（2）:140?147.DOI:10.1038/ng.1056.

［9］Takeichi T,Akiyama M.Inherited ichthyosis:Non?syndromicforms［J］.J Dermatol,2016,43（3）:242 ?251.DOI:10.1111/1346 ?8138.13243.

［10］Ahmad F,Ansar M,Mehmood S,et al.A novel missense variant in the PNPLA1 gene underlies congenital ichthyosis in three consanguineous families［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2016,30（12）:e210?210e213.DOI:10.1111/jdv.13540.

［11］Lee E,Rahman OU,Khan MT,et al.Whole exome analysis reveals a novel missense PNPLA1 variant that causes autosomal recessive congenital ichthyosis in a Pakistani family［J］.J Dermatol Sci,2016,82（1）:46?48.DOI:10.1016/j.jdermsci.2015.12.012.

［12］Fachal L,Rodríguez?Pazos L,Ginarte M,et al.Identification of a novel PNPLA1 mutation in a Spanish family with autosomal recessive congenital ichthyosis［J］.Br J Dermatol,2014,170（4）:980?982.DOI:10.1111/bjd.12757.

［13］Chang PA,Sun YJ,Huang FF,et al.Identification of human patatin?like phospholipase domain?containing protein 1 and a mutant in human cervical cancer HeLacells［J］.Mol Biol Rep,2013,40（10）:5597?5605.DOI:10.1007/s11033?013?2661?9.

［14］Kienesberger PC,Oberer M,Lass A,et al.Mammalian patatin domain containing proteins:a family with diverse lipolytic activities involved in multiple biological functions［J］.J Lipid Res,2009,50 Suppl:S63?68.DOI:10.1194/jlr.R800082?JLR200.

［15］Kalinin AE,Kajava AV,Steinert PM.Epithelial barrier function:assembly and structural features of the cornified cell envelope［J］.Bioessays,2002,24（9）:789?800.DOI:10.1002/bies.10144.

［16］Montealegre C,Verardo V,Luisa MM,et al.Analysis of glycerophospho ?and sphingolipids by CE［J］.Electrophoresis,2014,35（6）:779?792.DOI:10.1002/elps.201300534.

第三屆全國銀屑病學術會議征文通知

為了讓皮膚科醫師了解國內外關于銀屑病研究的最新動向，分享知名專家的臨床診治經驗，中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會定于2018年9月21-23日在上海召開“第三屆全國銀屑病學術會議”。會議將邀請國內外知名專家報告他們在銀屑病基礎與臨床的最新研究進展，演講者報告形式多樣、內容豐富。歡迎從事銀屑病基礎及臨床研究的皮膚科醫師和相關人員踴躍投稿和參會。

一、投稿要求：①投稿內容：銀屑病基礎研究論文、銀屑病臨床診斷和治療等方面的論文、典型與疑難病例等；②投稿方式：中文全文和400字以內的中文摘要，請通過電子郵件投稿，Email：pfkxh@126.com。來稿請注明第三屆全國銀屑病學術會議征文，截稿日期：2018年8月1日；③會議交流形式：特邀演講、大會發言、分會發言、書面交流。

二、聯系方式：上海市黃浦區成都北路500號峻嶺廣場19樓1908室，上海長征醫院《中國真菌學雜志》編輯部，郵編200003，Email：pfkxh@126.com，聯系人：施慧，021-81885497，手機13764560811。

Mutation analysis of the PNPLA1 gene in a family with autosomal recessive congenital ichthyosis

Zhao Huijuan,Yan Huimin,Guo Duyi,Zhu Peiqiu,Lei Pengcheng,Lu Xueyan,Jiang Wei
Department of Dermatology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

Jiang Wei,Email:jiangwei7366@163.com

ObjectiveTo identify a causative gene of autosomal recessive congenital ichthyosis（ARCI）in a Chinese family,and to analyze the genotype?phenotype correlation.MethodsPeripheral blood samples were collected from the proband,his elder brother and parents,and genomic DNA was extracted from these blood samples.Genome?wide exome sequencing was conducted to determine the mutation site in the proband,and then allele?specific oligonucleotide primers were designed based on the mutation site.PCR was performed to detect the mutation site to further identify the causative gene of ARCI in the family.ResultsA new homozygous missense mutation was identified in exon 4 in 1 allele of the PNPLA1 gene in the proband,which led to a codon change from cytosine（C）to thymine（T）at position 700（c.700C ＞ T）and resulted in the substitution of proline by serine（p.pro234ser）.The same mutation was also detected in the proband′s brother,and his parents were the mutation carriers.No mutations were found in unrelated healthy Chinese individuals.ConclusionThe missense mutation in the PNPLA1 gene（p.pro234ser）is associated with clinical symptoms of the patient with ARCI.

Genetic diseases,inborn;Chromosome disorders;Mutation;Genes,PNPLA1;Autosomal recessive congenital ichthyosis

姜薇，Email：jiangwei7366@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.005

國家自然科學基金（81201216）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81201216）

2016?09?28）

（本文編輯：吳曉初）