二甲雙胍對轉化生長因子β1誘導黑素瘤1205Lu細胞上皮-間質轉化及侵襲的影響

梁美琪 梁官釗 郭健 段昕所 陸潔

067020河北，承德醫學院附屬醫院皮膚科（第二作者現在中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所）

二甲雙胍對轉化生長因子β1誘導黑素瘤1205Lu細胞上皮-間質轉化及侵襲的影響

梁美琪 梁官釗 郭健 段昕所 陸潔

067020河北，承德醫學院附屬醫院皮膚科（第二作者現在中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所）

目的探討二甲雙胍在轉化生長因子β1（TGF?β1）誘導下，對黑素瘤1205Lu細胞上皮-間質轉化（EMT）過程及侵襲的影響。方法體外培養1205Lu細胞，分3組處理：空白對照組、TGF?β1（5 ng/ml）組、TGF?β1（5 ng/ml）+ 二甲雙胍（1 mmol/L）組。處理48 h后，顯微鏡下觀察各組細胞形態變化并采集照片。Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力，采用蛋白質印跡法和實時熒光定量RT?PCR技術分別測定細胞內N?鈣黏蛋白及基質金屬蛋白酶9（MMP?9）在蛋白質和mRNA水平上的表達，通過單因素方差分析及LSD?t法對結果進行統計學分析。結果與空白對照組相比，TGF?β1誘導1205Lu細胞向成纖維細胞樣形態轉變（同上皮-間質轉化樣改變），聯合二甲雙胍可逆轉上述形態改變。3組穿膜細胞數為空白對照組194.1± 8.295、TGF?β1組412.2± 13.427、TGF?β1+ 二甲雙胍組175.3±8.693。N鈣黏蛋白水平3組分別為0.603±0.029、1.963±0.016、0.207±0.009，mRNA水平3組分別為1.000±0.000、6.678±0.043、1.035±0.015。MMP?9蛋白水平3組分別為0.575±0.009、1.243±0.027、0.629±0.008，mRNA水平3組分別為1.000±0.000、5.351±0.604、0.930±0.130。結果經方差分析顯示，3組差異有統計學意義（P＜0.05）。結論二甲雙胍可顯著抑制TGF?β1誘導的黑素瘤1205Lu細胞EMT樣形態改變、細胞侵襲及N鈣黏蛋白、MMP?9在蛋白和mRNA水平上的表達。

黑色素瘤；二甲雙胍；轉化生長因子β1；上皮-間質轉化；侵襲

惡性黑素瘤是高致命性皮膚腫瘤，其侵襲、轉移能力強，一旦遠處轉移中位生存期為4～6個月，5年生存率 ＜ 10%［1］。上皮-間質轉化（EMT）即上皮型細胞向更具侵襲性的間質型細胞轉化過程，被認為是腫瘤細胞獲得惡性表型的關鍵機制，在腫瘤運動、侵襲等方面發揮重要作用?；啄そ到夂烷g質樣細胞形成標志著EMT的完成［2?3］。基質金屬蛋白酶（MMP）可降解細胞外基質和基底膜主要成分，參與腫瘤EMT過程，與腫瘤侵襲密切相關。N鈣黏蛋白為間質型細胞標志物，其表達上調標志EMT過程［4?6］。作為EMT的主要誘導因子，轉化生長因子β（TGF?β）通過誘導EMT、生成血管及抑制免疫等促進腫瘤運動、侵襲及轉移［7］。在前列腺癌、乳腺癌及肺癌研究中發現，降糖藥二甲雙胍能夠抑制TGF?β1誘導產生的EMT，而在黑素瘤領域尚無報道。為此，本研究探討二甲雙胍對TGF?β1誘導下黑素瘤細胞EMT過程及侵襲的影響。

資料與方法

一、資料

人黑素瘤1205Lu細胞株（第四軍醫大學西京醫院皮膚科實驗室惠贈），TGF?β1（美國Peprotech公司），二甲雙胍（批號BCBP0558V，純度≥97%，美國Sigma公司）、MCDB153培養基（美國Sigma公司），L15培養基、Transwell小室（美國Coning公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司），胰蛋白酶（美國Gibcol公司），N鈣黏蛋白、MMP?9、GAPDH正反向引物（大連Takara公司設計并合成），兔抗人N鈣黏蛋白單克隆抗體、兔抗人MMP?9單克隆抗體（英國Abcam公司），TRIzol（北京索萊寶科技有限公司），Fast Quant反轉錄試劑盒（天根生化科技有限公司），SYBR Green實時熒光定量PCR檢測試劑盒（美國Invitrogen公司），BCA蛋白定量試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司）。

二、方法

1.細胞培養：1205Lu細胞株用含4%胎牛血清的W489合成培養基（由75%MCDB153培養基和25%L15培養基組成），37℃、5%CO2條件下培養，每2～3天更換1次培養液，待細胞融合至80%～90%豐度時，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗1次，0.25%胰蛋白酶消化，完全培養基終止消化并將細胞調整至適宜密度后傳代培養或用于后續實驗。

2.分組及處理：實驗分為空白對照組、TGF?β1組、TGF?β1+二甲雙胍組3個組。取對數生長期1205Lu細胞，以5×105個/孔細胞數接種于6孔板，細胞單層鋪滿后棄去培養基并按分組給予如下處理：空白對照組加入無血清培養基；TGF?β1組加入含5 ng/ml TGF?β1的無血清培養基；TGF?β1+ 二甲雙胍組加入含5 ng/ml TGF?β1及1 mmol/L二甲雙胍的無血清培養基，培養48 h后觀察細胞形態并收集細胞進行蛋白質及mRNA檢測。

3.蛋白質印跡：細胞分組處理48 h后用預冷PBS漂洗2次，加入RIPA裂解液置于冰上裂解30 min，24 000×g離心15 min，取上清按BCA法測定各組蛋白濃度，每組取25 μg蛋白上樣，用8%SDS?PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離總蛋白，并轉印至PVDF（聚亞乙烯雙氧化物）膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，分別加入一抗即抗N鈣黏蛋白抗體（1∶1 000）、抗MMP?9抗體（1∶1 000）、抗β肌動蛋白抗體（1∶10 000）4℃孵育過夜，TBST清洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）室溫振蕩1.5 h，TBST清洗3次后加ECL發光液于暗室壓片曝光。實驗重復3次取均值。采用Gel?pro analyzer4圖像分析軟件測定條帶IOD值。目的蛋白N鈣黏蛋白及MMP?9與內參照β肌動蛋白IOD的比值反映其蛋白相對表達水平。

4.實時熒光定量RT?PCR：細胞分組處理48h后采用TRIzol法提取各組細胞總RNA，測定RNA純度及濃度，每組取等量RNA按反轉錄試劑盒說明書步驟合成cDNA，實時熒光定量PCR擴增目的基因N鈣黏蛋白、MMP?9和內參基因GAPDH。PCR反應體系（25 μl）：熒光染料12.5 μl，正、反向引物各1 μl，cDNA 模板 2 μl，無 RNA 酶水 8.5 μl，反應條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個循環。引物序列如下：N鈣黏蛋白正向引物：5′?CATCATCATCCTGCTTACCT TGT?3′，反向引物：5′?GGTCTTCTCCTCCACCTTCT T?3′；MMP?9正向引物：5′?ACGCACGACGTCTTCCA GTA?3′，反向引物：5′?CCACCTGGTTCAACTCACTC C?3′；GAPDH正向：5′?GCACCGTCAAGGCTGAGAA C?3′，反向：5′?TGGTGAAGACGCCAGTGGA?3′。實驗重復3次取均值。用2-△△Ct法分析目的基因N鈣黏蛋白、MMP?9的相對表達量。

5.Transwell侵襲試驗：將Transwell小室（孔徑8 μm）置于24孔板中，取50 μl Matrigel基質膠（PBS稀釋至0.1 mg/ml）包被小室膜，37℃孵育3 h，室溫風干16 h后每室加入50 μl無血清W489培養基37℃孵育24 h，使基質膠充分水化并棄去殘留培養基。取對數生長期細胞消化、計數，按分組制成含不同藥物（即5 ng/ml TGF?β1及其與1 mmol/L二甲雙胍聯合）的無血清細胞懸液（5×104個/ml），各取200 μl加入小室上層，小室下層加入600 μl含0.1%胎牛血清的W489培養基，培養48 h后棉簽拭去小室上層基質膠及細胞，無水甲醇固定15 min，0.1%結晶紫染色30 min，PBS漂洗2次。顯微鏡下觀察，每組隨機選取5個高倍（200×）視野計數，其平均值為每組細胞穿膜數目，每組實驗重復3次取均值。

6.統計學分析：結果采用SPSS19.0統計軟件處理且以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、二甲雙胍逆轉TGF?β1誘導下黑素瘤1205Lu細胞EMT樣形態改變

顯微鏡（×100）下觀察各組細胞形態：空白對照組細胞生長狀態良好，細胞呈多角形且分布均勻；TGF?β1誘導后細胞呈長梭形，似成纖維細胞，按平行、放射或旋渦狀排列分布，同EMT樣改變，說明1205Lu細胞在TGF?β1誘導下經歷EMT樣改變；加入二甲雙胍干預后細胞失去上述典型的間質型細胞形態，更接近空白對照組細胞形態，說明TGF?β1誘導的上述EMT樣形態改變在二甲雙胍作用下發生逆轉，即經歷MET樣改變。見圖1。

二、二甲雙胍抑制TGF?β1誘導下黑素瘤1205Lu細胞N鈣黏蛋白、MMP?9蛋白表達

TGF?β1誘導下N鈣黏蛋白、MMP?9蛋白相對表達水平顯著升高，與空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），即TGF?β1促進1205Lu細胞EMT及侵襲相關分子的蛋白表達，說明TGF?β1誘導下細胞經歷EMT過程；聯合二甲雙胍使N鈣黏蛋白、MMP?9蛋白表達較TGF?β1組明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1，圖2。

圖1 二甲雙胍對TGF?β1誘導黑素瘤1205Lu細胞形態變化的影響（×100） 空白對照組（1A）細胞呈多角形且分布均勻；TGF?β1組（1B）細胞呈狹長梭形，似成纖維細胞形態，呈平行、放射狀或旋渦狀排列；TGF?β1+二甲雙胍組（1C）細胞形態及分布介于兩者之間，更接近空白對照組

三、二甲雙胍抑制TGF?β1誘導下黑素瘤1205Lu細胞N鈣黏蛋白、MMP?9mRNA表達

LSD?t法兩兩比較顯示：TGF?β1組N鈣黏蛋白、MMP?9 mRNA相對表達量較空白對照組顯著升高（P＜0.05），即TGF?β1可促進上述EMT及侵襲相關分子mRNA表達；加入二甲雙胍干預后N鈣黏蛋白、MMP?9 mRNA表達下降，與TGF?β1組相比差異有統計學意義（P＜0.05），說明二甲雙胍抑制TGF?β1介導的1205Lu細胞EMT及侵襲相關分子在mRNA水平的表達，并與其蛋白質相對表達水平吻合。見表1。

四、二甲雙胍抑制TGF?β1誘導下黑素瘤1205Lu細胞侵襲

各組每高倍鏡（×200）視野下平均穿膜細胞數：空白對照組 194.1± 8.295，TGF?β1組 412.2±13.427，TGF?β1+ 二甲雙胍組175.3± 8.693。方差分析顯示各處理組差異有統計學意義（P＜0.05）。組間兩兩比較得出：TGF?β1組穿膜細胞數較空白對照組明顯增多（P＜ 0.05），提示TGF?β1誘導后細胞侵襲性增強；與二甲雙胍聯合作用后穿膜細胞數明顯減少，與TGF?β1組相比差異有統計學意義（P＜0.05），故二甲雙胍可抑制TGF?β1誘導下1205Lu細胞侵襲。見圖3。

表1 二甲雙胍對TGF?β1誘導黑素瘤1205Lu細胞N鈣黏蛋白、MMP?9蛋白及mRNA表達的影響（±s）

表1 二甲雙胍對TGF?β1誘導黑素瘤1205Lu細胞N鈣黏蛋白、MMP?9蛋白及mRNA表達的影響（±s）

注：n=3。MMP?9：基質金屬蛋白酶9；TGF?β1：轉化生長因子?β1；Met：二甲雙胍。a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與TGF?β1組比較，P＜ 0.05；c：與TGF?β1+Met組比較，P ＜ 0.05

組別空白對照組TGF?β1組TGF?β1+Met組F值P值MMP?9蛋白（IOD比值）0.575±0.009bc 1.243±0.027ac 0.629±0.008ab 2 893.601＜0.05 MMP?9mRNA（2-??Ct）1.000±0.000b 5.351±0.604ac 0.930±0.130b 151.034＜0.05 N鈣黏蛋白（IOD比值）0.603±0.029bc 1.963±0.164ac 0.207±0.009ab 6 450.497＜0.05 N鈣黏蛋白mRNA（2-??Ct）1.000±0.000b 6.678±0.043ac 1.035±0.015b 46 929.635＜0.05

圖2 二甲雙胍對TGF-β1誘導的黑素瘤1205Lu細胞N鈣黏蛋白、基質金屬蛋白酶9表達的影響（蛋白印跡結果） 1：空白對照組；2：TGF-β1組；3：TGF-β1+ 二甲雙胍組

圖3 二甲雙胍對TGF?β1誘導黑素瘤1205Lu細胞侵襲的影響（×200） 與空白對照組（3A）相比，TGF?β1組（3B）細胞穿過小室膜細胞數明顯增多；TGF?β1+二甲雙胍組（3C）穿膜細胞數較TGF?β1組明顯減少，與空白對照組比較，差異無統計學意義

討 論

黑素瘤由黑素細胞惡性轉化形成，其侵襲、轉移性強，一旦轉移治療方法有限，預后差，近30年發病速度在實體腫瘤中居首位，黑素瘤治療除早期發現和積極預防外亟待找到新的方法和作用靶點［1?2］。近年來，腫瘤細胞EMT過程已成為國內外研究熱點。EMT被認為是啟動腫瘤轉移的關鍵機制。其通過下調上皮細胞標記物（如E鈣黏蛋白），上調間質細胞標記物（如N鈣黏蛋白）以及MMP的表達使細胞間連接消失，細胞外基質降解，細胞運動及侵襲性增強［4］。MMP（尤其是MMP?2、MMP?9）能夠降解細胞外基質成分，促進細胞運動及侵襲，與腫瘤進展及EMT過程密切相關［6］。作為EMT主要誘導因子，TGF?β經Smad信號通路激活下游轉錄因子Snail，其通過下調E?鈣黏蛋白、上調MMPs（如MMP?9）表達，進而誘導 EMT 過程［4?5］。Javelaud等發現，阻斷1205Lu細胞TGF?β/Smad通路后MMP?9表達減少，細胞侵襲力下降，腫瘤生長及骨轉移速度減慢［8?9］。推測：TGF?β經Smad信號通路上調1205Lu細胞MMP?9表達，誘導EMT過程，促進細胞侵襲和轉移。故抑制TGF?β誘導的EMT及細胞侵襲為本次實驗的研究目標。

近年來，二甲雙胍抗腫瘤作用被人們廣泛認知及探討。流行病學研究顯示，服用二甲雙胍的糖尿病患者癌癥罹患風險明顯降低［10］。Cerezo等［11］證實，二甲雙胍能夠降低黑素瘤細胞中Snail、Slug及N鈣黏蛋白的表達，抑制腫瘤侵襲和轉移。此外，在前列腺癌、乳腺癌及肺癌研究中發現，二甲雙胍能夠抑制TGF?β1誘導的EMT過程［12?14］。本實驗旨在驗證二甲雙胍能否抑制黑素瘤細胞中TGF?β1誘導的EMT及細胞侵襲。我們選取黑素瘤1205Lu細胞作為實驗對象，其對外源性TGF?β存在強大的轉錄應答能力；具有配體介導下高度自主的TGF?β/Smad信號通路；并在Matrigel實驗中表現出高侵襲性［8］。通過檢測EMT及侵襲相關分子表達（N鈣黏蛋白、MMP?9），從分子水平論證藥物對EMT及侵襲的影響；同時檢測細胞形態和體外侵襲能力，從現象層面論證EMT過程及細胞侵襲。結果顯示：TGF?β1誘導后1205Lu細胞經歷EMT樣形態改變，N鈣黏蛋白、MMP?9表達上調，且細胞侵襲性增強，即TGF?β1誘導黑素瘤細胞EMT且伴隨細胞侵襲性增強；與二甲雙胍聯合作用可逆轉上述EMT樣形態變化，抑制N鈣黏蛋白、MMP?9表達及細胞侵襲。說明TGF?β1、EMT及MMP?9與黑素瘤細胞侵襲密切相關，故二甲雙胍可能通過抑制TGF?β1誘導的EMT過程及MMP?9表達從而降低1205Lu細胞侵襲性。

綜上所述，我們證實TGF?β1能夠誘導黑素瘤1205Lu細胞EMT并增強細胞侵襲性。繼前列腺癌、乳腺癌、肺癌之后，證實二甲雙胍能夠抑制TGF?β1誘導的黑素瘤細胞EMT及侵襲。為二甲雙胍抗黑素瘤提供新的依據，然而通過何種途徑抑制上述過程尚待進一步研究。

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奇正青鵬軟膏有獎征文通知

為了更好地發揮藏藥在皮膚病治療中的作用，西藏奇正藏藥股份有限公司與《中華皮膚科雜志》編輯部、中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會環境與職業性皮膚病學組共同開展2017年奇正青鵬軟膏有獎征文活動，歡迎皮膚科醫師踴躍參加。

一、征文范圍

①單用奇正青鵬軟膏治療各種濕疹皮炎臨床療效的經驗總結（有對照組）；②觀察單用奇正青鵬軟膏治療皮炎濕疹等皮膚科常見瘙癢癥狀的起效時間和療效的研究（有對照組）；③觀察青鵬軟膏保護皮膚屏障的作用及其在濕疹治療中的意義（有對照組）。

二、活動形式

論文提交截稿日期2018年3月1日。在此期間完成的研究論文均可參加活動，并在2018年中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會年會期間進行評比和頒獎。本次征文共設如下獎項：第1～3名將分別獲得8 000元、5 000元、3 000元的研究基金；優秀征文獎20名，分別獲得1 000元研究基金，以上獲獎者均頒發中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會環境與職業性皮膚病學組研究基金獲獎證書。

請將論文Word電子版發至Email：wwz1602@qzh.cn或jiangli0828@163.com，主題注明奇正青鵬軟膏征文。

西藏奇正藏藥股份有限公司有權使用征文稿件，并擁有此次活動的解釋權。

Effects of metformin on transforming growth factor?beta1?induced epithelial?mesenchymal transition and invasion in the human melanoma cell line 1205Lu

Liang Meiqi,Liang Guanzhao,Guo Jian,Duan Xinsuo,Lu Jie
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Chengde Medical University,Chengde 067020,Hebei,China（Liang MQ,Liang GZ［current affiliation:Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China］,Guo J,Duan XS,Lu J）

Lu Jie,Email:chengdejiel@163.com

ObjectiveTo evaluate the effects of metformin on transforming growth factor?beta1（TGF?β1）?induced epithelial?mesenchymal transition（EMT）in and invasion of the human melanoma cell line 1205Lu.MethodsIn vitrocultured 1205Lu cells were divided into 3 groups to be treated with serum?free culture medium（blank control group）,serum?free culture medium containing 5 ng/ml TGF?β1（TGF?β 1 group）and serum?free culture medium containing 5 ng/ml TGF?β1 and 1 mmol/L metformin（TGF?β1+metformin group）,respectively.After 48?hour treatment,morphological changes of 1205Lu cells in the above groups were observed by using a microscope,and photos were taken at the same time.Transwell invasion assay was performed to estimate cellular invasive activity,Western blot analysis and real?time fluorescence?based quantitative RT?PCR were conducted to determine the mRNA and protein expression of N?cadherin and matrix metalloproteinase?9（MMP?9）,respectively.Statistical analysis was carried out by one?way analysis of variance（ANOVA）and least significant difference（LSD）test.ResultsCompared with the blank control group,the stimulation of TGF?β1 could induce the epithelial?mesenchymal transition（EMT）?like morphological changes in 1205Lu cells,while TGF?β1 combined with metformin could reverse the EMT?like morpho?logical changes.The number of 1205Lu cells crossing the transwell Matrigel per high?power field（× 200）was significantly higher in the TGF?β1 group（412.2 ± 13.427）than in the blank control group（194.1 ± 8.295）and TGF?β1+metformin group（175.3 ± 8.693）.Compared with the blank control group and TGF?β1+metformin group,the TGF?β1 group also showed significantly increased mRNA and protein expression of N?cadherin（mRNA:6.678±0.043vs.1.000±0.000,1.035±0.015;protein:1.963±0.016vs.0.603±0.029,0.207±0.009）andMMP?9（mRNA:5.351±0.604vs.1.000±0.000,0.930±0.130;protein:1.243±0.027vs.0.575±0.009,0.629±0.008）.ConclusionMetformin can obviously inhibit TGF?β1?induced EMT?like morphological changes in,the capacity to penetrate Matrigel?coated transwell chambers of and the mRNA and protein expression of N?cadherin and MMP?9 in 1205Lu cells.

Melanoma;Metformin;Transforming growth factor?beta1;Epithelial?mesenchymal transition;Invasion

陸潔，Email：chengdejiel@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.009

2016?09?18）

（本文編輯：吳曉初）