二氫楊梅素對裸鼠腹腔移植人胃癌細胞中Caveolin-1表達的影響*

王佑權，張帆，周壽紅

（1.南華大學附屬第二醫院 腫瘤外科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫學院生理學教研室，湖南 衡陽 421001）

二氫楊梅素對裸鼠腹腔移植人胃癌細胞中Caveolin-1表達的影響*

王佑權1，張帆1，周壽紅2

（1.南華大學附屬第二醫院 腫瘤外科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫學院生理學教研室，湖南 衡陽 421001）

目的觀察二氫楊梅素（DMY）對裸鼠腹腔移植人胃癌細胞生長的抑制作用及對腹腔瘤組織中Caveolin-1表達的影響。方法復制人胃癌腹腔移植的裸鼠模型。將復模成功的24只裸鼠隨機分為4組，即移植瘤模型組，DMY低、中及高劑量處理組。分別觀察荷瘤裸鼠的腹腔移植瘤的生長和成瘤情況，測量腫瘤的重量、長短徑并計算腫瘤的體積。采用免疫組織化學法和Western blot檢測人胃癌腹腔移植瘤腹腔瘤體中Caveolin-1和Ki67的表達。結果與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤成瘤個數，腹腔瘤體的重量及腹腔瘤體的體積均降低，呈現劑量依賴性（P＜0.05），裸鼠的食欲、活動情況和精神狀態等一般情況改善。與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤體表達Caveolin-1的陽性細胞百分率和Caveolin-1的蛋白表達水平均增加，呈現劑量依賴性（P＜0.05）；而Ki67的陽性細胞百分率和Caveolin-1的蛋白表達水平均降低，也呈現劑量依賴性（P＜0.05）。結論二氫楊梅素以劑量依賴的方式抑制人胃癌腹腔移植瘤的生長，其作用機制可能與上調Caveolin-1的表達有關。

二氫楊梅素；胃癌；裸鼠；腹腔移植瘤；小凹蛋白-1

在我國每年約有36萬人死于胃癌，占女性惡性腫瘤死因的第2位，男性的第3位[1]。胃癌的復發和轉移是導致患者死亡的主要原因，進行過胃癌根治性術的患者，其5年生存率也只有30%左右[2]。因此，抑制胃癌浸潤和轉移是提高胃癌患者的生存率及生活質量的主要任務。然而目前，盡管在防治腫瘤轉移的方面開展大量的研究，但效果仍然不理想。近年來，中醫藥腫瘤防治領域中作用和優勢越來越受到人們的關注。藤茶是一種廣泛分布于我國長江流域以南地區的藥食兩用植物，長期用作茶類植物和中草藥。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種二氫黃酮醇類化合物，主要從藤茶莖葉中提取。DMY具有鎮痛、抗炎、抗氧化、止咳及調節免疫功能等作用[3-4]。近年來的研究發現，DMY具有抗腫瘤的作用，研究顯示DMY以劑量依賴的方式誘導肺癌細胞A549細胞的凋亡，下調Bcl-2的表達而上調Bax的表達[5]。研究發現，DMY[100 mg/（kg·d）]灌胃處理減少小鼠乳腺癌肺轉移瘤的瘤重和轉移灶的數量[6]。Caveolae-1是Caveolae的標志性蛋白，Caveolin-1通過磷酸化與去磷酸化的方式與基質金屬蛋白酶、Paxilli和E-鈣粘蛋白等信號分子產生相互作用，參與腫瘤細胞的黏附、增殖、凋亡及遷移等過程的調控[7-8]。研究顯示，抑制Caveolin-1的表達可促進胃癌細胞的生長和增生[9]。因此，本研究擬觀察DMY對裸鼠腹腔移植人胃癌細胞生長的抑制作用，并從Caveolin-1的角度探討其可能的機制，為胃癌的的防治提供新的靶點和策略。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

人胃低分化黏液腺癌細胞株MGC-803細胞（由上海吉瑪制藥技術有限公司提供），DMY（購自成都曼斯特生物科技公司），DMEM細胞培養液和胎牛血清（購自Hyclone公司），免疫組織化學（免疫組織化學）染色試劑盒（購自北京博奧森生物技術有限公司），BCA蛋白定量試劑（購自Invitrogen公司），一抗兔抗人Caveolin-1單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗（購自美國Santa Cruz公司）。

1.2 實驗動物

選取35只4周齡雄性裸鼠，體重16～18 g/只，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2015～0001，飼養于本校動物實驗中心無特殊病原體（SPF）級實驗室（許可證號：SYXK（湘）2010～0006）。

1.3 細胞培養與人胃癌裸鼠腹腔種植模型的復制

采用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養人胃低分化黏液腺癌細胞株MGC-803細胞，在37℃、5%二氧化碳CO2的細胞培養箱中培養。取對數生長期的細胞，胰酶消化后，制成單細胞懸液，調整密度為 5×107個 /ml，按 0.2 ml/只（約為 1×107個細胞）將細胞懸液注射到裸鼠的腹腔內，正常對照裸鼠組腹腔注射等量的生理鹽水。操作完成后裸鼠均正常喂養。

1.4 實驗分組及給藥

將復模成功的裸鼠隨機分為4組，即移植瘤模型組，DMY低、中及高劑量處理組，每組6只。接種后第18天開始藥物處理，DMY低、中和高劑量分別按50、100和200 mg/（kg·d）灌胃給藥。對照組裸鼠，給予相同體積的生理鹽水灌胃處理。DMY組每天給藥1次，連續30 d。觀察并記錄裸鼠的情況（外觀、精神、飲食、活動情況和全身改變情況）以及裸鼠腹腔移植瘤生長情況。末次給藥后7 d處死裸鼠。開腹解剖，取出腹腔瘤體，稱量其重量，腹腔瘤體的長短徑，計算腹腔瘤體的體積。計算抑瘤率=（移植瘤模型組的瘤重-處理組的瘤重）/移植瘤模型組的瘤重×100%。

1.5 HE染色和免疫組織化學檢測

腹腔瘤體甲醇固定后進行石蠟切片和HE染色，光鏡下觀察形態學的變化。石蠟切片在脫蠟后，通過煮沸修復抗原，脫脂奶粉封閉，一抗（1∶200）孵育，在4℃條件下過夜。清洗后二抗孵育，在37℃30 min，DAB顯色，鏡下控制反應，及時終止反應。蘇木素復染，烘干，透明，封片，顯微鏡下觀察拍照記錄結果。Image-Pro Plus圖像分析系統測定光密度，進行半定量分析。

1.6 Western blot檢測

取適量的腹腔瘤體放入碾缽中，加入蛋白裂解液，按試劑盒說明提取組織總蛋白。測定樣本的蛋白濃度，2×SDS凝膠加樣緩沖液溶解蛋白樣本，煮沸。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜。PVDF膜用10%脫脂牛奶封閉非特異性抗原，在室溫下孵育2 h。加入兔抗人Caveolin-1（1∶400）、Ki67 和 β-actin（1∶1000）的一抗，4℃下孵育過夜。清洗后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，4℃下繼續孵育4 h。洗膜后用ECL法顯色并曝光成像于X線，經顯影、定影后，以β-actin作為內參照，應用凝膠圖像分析軟件對膠片掃描，分析目的蛋白的表達水平。

1.7 統計學方法

數據處理采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠的一般情況觀察

在接種后15d，移植瘤模型組的裸鼠腹部可捫及瘤結節，隨著時間的增長，捫及的瘤結節不斷增大，30 d時就可用注射器從腹腔中抽出少量血性腹水，裸鼠的腹部隆起越來越明顯，裸鼠的食欲明顯減退、活動明顯減少、出現精神萎靡和體重減輕等情況。將裸鼠解剖后觀察到裸鼠腹腔內有明顯血性腹水，肝周、腸系膜、網膜、橫膈、腹膜、腹壁和盆腔等地方可見灰白色0.1～3.0 cm大小不等的腫瘤結節，質地較硬，結節與周圍組織有粘連，部分出現壞死，表明腫瘤移植成功，腹腔移植成功率為100%。與移植瘤模型組比較，DMY中及高劑量處理組腹部可捫及瘤結節較小，30 d時不能從腹腔中抽出血性腹水，裸鼠腹部隆起較小，裸鼠食欲和活動情況正常，精神狀態良好。而DMY低劑量處理組組與移植瘤模型組以上癥狀無差異。見圖1、2。

2.2 DMY對人胃癌腹腔移植瘤生長的抑制作用

各組腹腔移植瘤成瘤個數、瘤體的重量和體積差異有統計學意義（F=53.763、34.192和 48.114，P=0.001、0.011和0.001）。與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤成瘤個數（t=3.751和 4.762，均P=0.001），瘤體的重量及體積均降低（均P＜0.05），呈現劑量依賴性。50mg/（kg·d）DMY低劑量組與移植瘤模型組成瘤個數（t=0.773，P=0.542），瘤體的重量（t=1.152，P=0.363）及最大瘤體的體積（t=1.041，P=0.413）均差異無統計學意義。50、100 和 200 mg/（kg·d）DMY 的抑瘤率分別為5.76%、38.43%和41.29%，提示高、中劑量的DMY對人胃癌腹腔移植瘤有抑制作用。見圖3。

圖1 各組裸鼠腹部外觀

圖2 各組裸鼠腹部解剖情況

2.3 DMY對人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Ki67表達的影響

采用免疫組織化學和Western blot檢測人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Ki67的表達，各組表達Ki67的陽性細胞百分率的差異有統計學意義（F=24.632，P=0.001）。見圖4A、B。與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤體表達Ki67的陽性細胞百分率降低，呈現劑量依賴性（均P＜0.05）。與移植瘤模型組比較，100和200mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤體中Ki67的表達水平降低，呈現劑量依賴性（均P＜0.05）。見圖4C、D。

2.4 DMY對人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Caveolin-1表達的影響

采用免疫組織化學和Westernblot檢測人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Caveolin-1的表達，各組表達Caveolin-1的陽性細胞百分率的差異有統計學意義（F=32.541，P＜0.05）。見圖 5A、B。與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤表達Caveolin-1的陽性細胞百分率增加（均P＜0.05），呈現劑量依賴性。與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤中Caveolin-1的表達水平增加（均P＜0.05），呈現劑量依賴性。見圖5C、D。

圖3 DMY對人胃癌腹腔移植瘤腹腔成瘤個數、瘤重和瘤體積的影響及腫瘤抑制率

圖4 人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Ki67的表達 （×400）

圖5 人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Caveolin-1的表達（×400）

3 討論

隨著社會和生活壓力的增加以及飲食結構和環境的變化，胃癌的發病率一直居高不下，而發病的年齡呈現出年輕化的態勢[10-11]。手術切除腫塊依然是目前胃癌的主要治療手段，但手術后有50%的患者在5年內出現復發或遠處轉移[12]。胃癌患者術后復發和轉移的主要原因是術前已經存在于腹腔的微小轉移灶和手術過程中產生的游離的癌細胞。因此提高胃癌患者的生存率和生存質量的關鍵是有效預防和及時治療腫瘤的腹腔轉移。

DMY是一種在藤茶中的含量較高的黃酮類化合物，也大量地存在于葡萄、楊梅和蔬菜中。DMY具有廣泛的藥理作用，近年來發現DMY具有抗腫瘤的功效。研究顯示，DMY能升高肺癌細胞系AGZY-83-a細胞中Caspase-3的活性和鈣離子濃度，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[13]。DMY也抑制肝癌細胞系HepG2細胞的生長，誘導其細胞凋亡[14]。DMY還能抑制小鼠B16黑色素瘤細胞的增殖、高轉移型乳腺癌MDA-MB-231細胞和胃癌細胞SGC-7901細胞的增殖[15-16]。DMY也能抑制在體腫瘤的生長，DMY能減少小鼠乳腺癌肺轉移腫瘤的重量和肺轉移灶的數量[6]。DMY能抑制人肺癌GLC 82裸鼠移植瘤和人肝癌Bel27402裸鼠移植瘤的生長[17]。本實驗結果顯示，中、高劑量DMY能改善裸鼠的食欲、活動情況和精神狀態等一般情況，能降低裸鼠的腹腔移植瘤成瘤個數，腹腔瘤體的重量及腹腔瘤體的體積。本結果表明，DMY有抗胃癌腹腔轉移作用，并可抑制胃癌腹腔轉移瘤生的長。Ki67是一種核抗原，與細胞增殖特異性相關。靜止期的細胞不表達Ki67，而增殖期細胞的細胞核中表達，常用來評估細胞的增殖水平。本研究結果也顯示中、高劑量DMY降低裸鼠腹腔移植瘤體中表達Ki67的陽性細胞百分率和Ki67的蛋白表達水平，提示DMY可能是通過抑制胃癌細胞增殖，而發揮其抗胃癌效應的，但是其詳細機制不清楚。

Caveolin-1是1個抑癌基因，通過磷酸化和去磷酸化的方式與很多信號分子發生相互作用，參與腫瘤細胞的黏附、增殖、凋亡和遷移等生物學行為的控制。研究顯示，在肉瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤中Caveolin-1的表達均降低[18]。非貼壁依賴性生長（anchorage-independent cell growth，AICG）是惡性轉化的細胞及具有較強轉移能力的腫瘤細胞的生長特征。具有AICG特征的細胞可表現為細胞伸展出片層偽足，生長過程中未接觸性抑制，AICG與腫瘤侵襲和轉移密切相關。研究發現，Caveolin-1高表達于人乳腺癌細胞中可以抑制其AICG的特性[19]。研究顯示，在乳腺癌細胞中存在132位密碼子突變，而將突變型Caveolin-1基因導入NIH 3T3細胞中，發現可使NIH 3T3細胞獲得AICG的特性，細胞的侵襲能力也增強[20]。在本研究中結果顯示，與移植瘤模型組比較，中、高劑量DMY組裸鼠腹腔移植瘤體中表達Caveolin-1的陽性細胞百分率和Caveolin-1的蛋白表達水平均增加，呈現劑量依賴性。

總之，本研究結果表明，二氫楊梅素以劑量依賴的方式抑制人胃癌腹腔移植瘤的生長，其作用機制可能與上調Caveolin-1的表達有關。

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Effect of Dihydromyricetin on caveolin-1 in nude mouse models of human gastric cancer*

You-quan Wang1,Fan Zhang1,Shou-hong Zhou2
(1.Department of Oncological Surgery,the Second Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Physiology,Medical College of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo investigate inhibitory effect of Dihydromyricetin (DMY)on the growth of gastric cancer and expression of caveolin-1 in nude mouse models of human gastric cancer.MethodsNude mouse models of peritoneal transplanted human gastric cancer was established.Twenty-four successfully transplanted nude mice were randomly divided into 4 groups:tumor group,tumor with low dose group[50 mg/（kg·d）],moderate dose group[100 mg/（kg·d）]and high dose group[200 mg/（kg·d）]of DMY.The growth rate and tumorsize were monitored.The expression levelsofcaveolin-1 and Ki67 so caveolin-1 lin 1 by Immunohistochemistry and Western blot.ResultsThe number,weight,and volume of tumors were significantly decreased in both tumor with moderate and high dose groups dose dependently when compared with the tumor group(P＜0.05).The appetite,activity and mental state of animals in the tumor with moderate and high dose groups were significantly improved in comparison with the tumor group.Immunohistochemistry and Western blot data indicated that the percentage of Caveolin-1 positive cells and expression level of proteinCaveolin-1 were significantly increased in the tumor with moderate and high dose groups when compared with the tumor group dose dependently (P＜0.05).Similarly,the percentage of Ki67 positive cells and expression level were significantly increased in the moderate and high dose groups when compared with the tumor group dose dependently (P＜0.05).ConclusionsDMY inhibits the growth of peritoneal transplanted human gastric cancer in dose dependent manner and the mechanism may be related to upregulation of Caveolin-1.

Dihydromyricetin;gastric cancer;nude mice;peritoneal transplantable tumor;Caveolin-1

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.003

1005-8982（2017）24-0011-06

2017-07-11

湖南省教育廳科研項目（No：11c1108）

周壽紅，E-mail：zhoushouhong@126.com

（王榮兵 編輯）