土壤中重金屬的生物有效性分析方法及其影響因素綜述*

楊 潔 瞿 攀 王金生 滕彥國 左 銳

(1.北京師范大學水科學研究院，北京 100875；2.地下水污染控制與修復教育部工程研究中心，北京 100875)

土壤中重金屬的生物有效性分析方法及其影響因素綜述*

楊 潔1,2瞿 攀1#王金生1,2滕彥國1,2左 銳1,2

(1.北京師范大學水科學研究院，北京 100875；2.地下水污染控制與修復教育部工程研究中心，北京 100875)

土壤環境質量關系著糧食安全和生態安全。對土壤環境質量進行正確的評價尤為重要，而重金屬的生物有效性對于揭示環境污染程度和評價生態風險具有重要意義，因此探尋土壤中重金屬生物有效性的分析方法是目前國內外研究的熱點。主要介紹了化學試劑提取法、薄膜擴散梯度技術(DGT)、道南膜技術(DMT)和同位素稀釋法在重金屬生物有效性分析方面的應用，并歸納了影響重金屬生物有效性的主要因素，為重金屬生物有效性分析方法的統一提供參考。

土壤 重金屬 生物有效性 分析方法

土壤是重要的自然資源，也是農業生產的基礎。近年來，土壤重金屬污染帶來的環境問題引起了人們的廣泛關注[1-2]。重金屬進入土壤后，一般積累在土壤表層，不易遷移，但仍有少部分重金屬能通過植物吸收、地表徑流和淋溶等途徑最終危害人體健康。土壤中重金屬含量不太高時，對作物的生長基本無影響，但當其含量超過一定值之后，就會導致作物減產甚至死亡，或者造成作物體內的重金屬含量超過食品衛生相關標準甚至危害人體健康[3]。雖然重金屬總量能在一定程度上反映土壤受污染的情況，但并不能表征其污染特征及危害程度。土壤中重金屬的危害程度是由其活動性決定的，因此有學者提出重金屬生物有效性的概念，認為該部分重金屬可被生物直接吸收利用或對生物造成毒性，土壤中重金屬的生物有效性不僅與重金屬的總量有關，更大程度上取決于重金屬的形態，不同形態的重金屬會產生不同的環境效應[4]。因此，借助生物有效性分析闡明重金屬的毒性和生物可利用性，揭示重金屬在土壤中的污染特征，對于研究重金屬的環境效應及污染土壤的治理和修復具有重要意義。

目前，許多學者采用各種方法對土壤中重金屬的生物有效性進行了研究，由于土壤中重金屬生物有效性的影響因素較多，如重金屬總量、土壤理化性質、根系分泌物、施肥等，因此對于不同的土壤，其分析方法有所不同。本研究介紹了國內外常用的重金屬生物有效性的分析方法，以及土壤環境對重金屬生物有效性的影響，為重金屬生物有效性分析方法的統一提供參考。

1 土壤重金屬生物有效性的分析方法

目前，主要依據重金屬的總量進行土壤環境質量評價，但實際對人體健康造成危害的是具有生物有效性的重金屬，因此采用重金屬總量來評價土壤環境質量并不合理。只有了解重金屬的生物有效性，才能對重金屬的環境風險及危害程度進行更為準確的評價。土壤中重金屬生物有效性常用的分析方法有化學試劑提取法、道南膜技術(DMT)、薄膜擴散梯度技術(DGT)和同位素稀釋法等。

表1 指示不同酸堿性土壤中重金屬生物有效性的提取劑

注：1)酸性(pH<6.5)、中性(6.5≤pH≤7.5)、堿性(pH>7.5)；2)Cu、Fe、Mn、Zn、Cd、Cr、Ni、Pb參照《土壤質量通過緩沖的DPTA溶解作用提取痕量元素》(ISO 14870—2001)，Zn、Mn、Fe、Cu和Pb、Cd也可分別參照《土壤有效態鋅、錳、鐵、銅含量的測定二乙三胺五乙酸(DPTA)浸提法》(NY/T 890—2004)和《土壤質量有效態鉛和鎘的測定原子吸收法》(GB/T 23739—2009)。

1.1 化學試劑提取法

化學試劑提取法根據提取次數分為單級提取法和連續提取法，是研究重金屬生物有效性最常用的方法。

1.1.1 單級提取法

單級提取法是將一種或幾種混合的化學試劑與土壤按一定的土液比和提取方法，提取一次，然后測定溶液中重金屬含量的方法。

其中常用的提取劑有絡合劑(二乙三胺五乙酸(DPTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)等)、稀酸溶液(CH3COOH、HCl、HNO3等)、無機鹽溶液(CaCl2、NaNO3等)等。絡合劑通過與土壤中金屬離子發生絡合作用而使重金屬穩定存在于提取液中，能模擬植物根系分泌物對重金屬的活化作用，DPTA、EDTA常被用于研究重金屬的生物有效性，絡合劑與無機鹽、稀酸組成混合溶液可以提高提取效率。稀酸溶液主要用于酸性土壤中，其中HCl是最常用的試劑，張傳琦[5]研究指出，HCl提取的酸性土壤中的As、Cd、Hg、Pb與茶葉、禾本科草類植物的吸收量具有很好的相關性。無機鹽溶液可通過離子交換作用提取水溶態和可交換態重金屬，其中CaCl2在許多研究中被認為是很好的研究重金屬生物有效性的提取劑[6-8]。

由于提取劑的提取機制不同，不同提取劑的測定結果有較大差異。比較不同提取劑對重金屬的提取量與植物對重金屬的吸收量之間的相關性，可以反映重金屬的生物有效性，其中相關性較好的提取劑可以預測植物對重金屬的吸收量，從而指示重金屬的生物有效性。

土壤pH對重金屬生物有效性有較大影響，對不同pH的土壤選用不同的提取劑，可提高提取效率。根據各文獻中的研究結果，將不同酸堿性土壤中能較好指示各重金屬生物有效性的提取劑列于表1。其中DPTA、NaNO3、CH3COONa等能指示堿性或中性土壤中重金屬生物有效性，EDTA、HCl、CaCl2、CH3COONH4、Ca(NO3)2、NaH2PO4等能指示酸性或中性土壤中重金屬生物有效性。

陶文靖等[25]以pH為7.5作為界限，建立了As、Cd、Cr、Cu、Hg和Tl在不同土壤pH條件下提取重金屬有效態的方法，并用該方法測定了3個國家一級標準物質GBW7412、GBW7413和GBW7416中重金屬元素的有效態含量，其精密度為6.01%～19.30%。但土壤pH并不是影響重金屬生物有效性的唯一因素，因此需要更深入地研究不同土壤環境下適用的提取劑及提取方法，真實評價土壤中重金屬的污染狀況。

常規的單一提取劑通常只對一種或兩種重金屬具有較好的效果，在分析多種重金屬的生物有效性時，需要花費較多的時間及成本。而聯合提取劑將多種試劑混合，一步提取土壤中重金屬，具有操作簡單、提取時間短、可提取多種元素等優點，并與傳統提取劑提取的結果有較好的相關性。土壤養分狀況系統研究法(ASI法)和Mehlich-3通用浸提劑(M3法)所用的聯合提取劑是目前比較常用的。ASI法采用0.25 mol/L的NaHCO3、0.01 mol/L的EDTA和0.01 mol/L的NH4F 3種提取劑混合用于提取并測定土壤中重金屬有效態的含量。M3法的成分為0.2 mol/L的CH3COOH、0.25 mol/L的NH4NO3、0.015 mol/L的NH4F、0.013 mol/L的HNO3、0.001 mol/L的EDTA，pH為2.5±0.1。ASI法和M3法的提取劑均含有無機鹽組成的緩沖溶液和絡合劑，可以將土壤中可交換態、部分碳酸鹽結合態和有機結合態的重金屬提取出來，而這些形態的重金屬和植物吸收的重金屬具有較好的相關性，因此也得到了廣泛應用。

喻華等[26]研究發現，ASI法和常規方法提取的Cu、Mn、Zn含量以及小麥吸收量呈極顯著或顯著正相關關系，而ASI法和常規方法提取的Fe含量以及小麥吸收量無顯著相關關系。劉肅等[27]、靳霞等[28]、陸文利等[29]發現M3法與常規方法提取的重金屬之間的相關性較好，且M3法提取的重金屬含量高于常規方法，而且M3法適用于酸性、中性、堿性及石灰性等各類土壤。說明聯合提取劑可作為重金屬生物有效態的提取劑，并且在一些土壤中的效果優于常規的單一提取劑。但聯合提取劑并不是在所有研究中都有很好的效果，如顧國平等[30]和褚卓棟等[31]的研究均表明采用常規方法能更好地反映重金屬的生物有效性。因此，針對不同的土壤環境和重金屬，需要采用不同的提取劑來指示重金屬在土壤中的生物有效性，從而反映出土壤環境的污染特征和危害程度。

1.1.2 連續提取法

為了提高提取劑的選擇性，可利用連續提取法來代替單級提取法。連續提取法根據重金屬在土壤中賦存形態的差異，采用不同的提取劑逐級分離這些形態。如Tessier法將土壤中重金屬的形態分為可交換態、碳酸鹽結合態、鐵錳氧化物結合態、有機及硫化物結合態、殘渣態5種形態[32]；歐洲共同體標準物質局提出的BCR法分為弱酸提取態、可還原態、可氧化態和殘渣態4種形態[33]。重金屬的化學形態是影響重金屬生物有效性、溶解性和遷移性最重要的因素之一[34]。其中，Tessier法的前兩種或BCR法的第一種形態一般被認為具有生物有效性，而除殘渣態之外的形態可能會在環境發生改變后轉化為易被生物利用的形態，因此是具有潛在生物有效性的形態。有學者通過研究重金屬的化學形態分析重金屬的生物有效性，評價其環境風險，一般用生物活性系數(MF)來表示[35]，計算公式為：

(1)

式中：F1為弱酸提取態(可交換態和碳酸鹽結合態)；F2為可還原態(鐵錳氧化物結合態)；F3為可氧化態(有機及硫化物結合態)；F4為殘渣態。

林躍勝等[36]通過上述兩種方法研究均發現，土壤中Zn的活性最大，因此Zn的生物有效性最強，具有較高的環境風險。滕彥國等[37]采用BCR法測定了攀枝花礦區土壤中V的形態，其中弱酸提取態所占的比例最小，為0.37%～1.85%，生物有效性較低，因此對環境的危害小。這說明連續提取法也可作為表征重金屬生物有效性和評價環境風險的方法。但采用連續提取法研究重金屬的生物有效性過于繁瑣，且其形態的分類與生物有效性的定義也有所差異，因此一些學者還是選擇采用快速有效的單級提取法來分析重金屬的生物有效性。YANG等[21]研究發現，單級提取法和BCR法提取的V含量與紫花苜蓿(Medicagosativa)吸收量的相關性差別不大，說明單級提取法可以作為快速鑒別V生物有效性的有效方法，但連續提取法對于研究重金屬的遷移轉化規律有一定的重要性。

1.2 DMT

大多數情況下，自由態重金屬離子濃度是決定重金屬生物有效性和毒性的關鍵因素[38]。DMT采用陽離子交換膜將給體池和受體池隔開，給體池中的自由態重金屬離子透過陽離子交換膜進入受體池，最后達到平衡。通過測定受體池中重金屬離子濃度，從而計算出給體池中自由態重金屬離子濃度。該方法的主要優點是可以同時測定多種重金屬元素且對待測體系干擾小，應用范圍較廣[39-40]。該方法測定值與模型的計算值吻合度較好，可以通過模型計算預測土壤中重金屬的生物有效性。王瑜等[41]通過研究發現，自由態Cd離子濃度與重金屬結合(WinHumicV)模型計算的結果具有較高的一致性，且番茄的生物量及對Cd的吸收量均與自由態Cd離子濃度有較好的相關性，因此自由態Cd離子是土壤溶液中具有生物有效性的主要Cd形態。趙磊等[42]等發現，土壤中溶解態和自由態重金屬離子濃度主要受重金屬總量、土壤pH及溶解態有機碳(DOC)控制。但也有研究認為自由態重金屬離子濃度并不能較好預測重金屬的生物有效性[43]。

1.3 DGT

DGT采用可滲入離子的水凝膠將離子交換樹脂和溶液分隔開，通過水凝膠控制離子交換，模擬植物吸收重金屬的過程來分析重金屬的生物有效性[44]。DGT裝置主要由擴散相和結合相兩部分組成，待測物質通過擴散相，在結合相中被積累，確定了結合相中反應物的質量，就可以計算待測物質中重金屬離子的濃度。因此擴散相和結合相的性能是DGT測定重金屬生物有效態的主要影響因素。該方法還能原位測定土壤中重金屬的有效組分，避免采樣、前處理及提取過程中重金屬形態的變化，且幾乎不受土壤基本性質的影響[45]。ZHANG等[46]和宋寧寧等[47]研究表明，DGT測定的Cu和Cd含量與植物吸收具有很好的相關性，DGT能較準確地預測重金屬的生物有效性。但DGT并不能完全模擬植物生長的環境，植物根系分泌物、微生物等均是植物吸收重金屬不容忽視的影響因素。

1.4 同位素稀釋法

同位素稀釋法可以直接測定土壤中元素的可交換態含量。由于同位素的化學性質和物理性質基本相同，同位素將與土壤固相中具有遷移性和生物有效性的元素進行交換，通過測定該元素同位素豐度的變化即L值，可得到可交換態離子濃度即E值，或通過培養植物，測定L值[48]。若忽略植物根際效應等影響重金屬生物有效性的因素，E值和L值應該一致。近年來，使用穩定同位素作為示蹤劑聯合使用電感耦合等離子體質譜儀進行測定的技術日趨成熟，在測定重金屬生物有效態方面有較多的應用[49-51]。同位素稀釋法不會干擾離子在土壤多相組分之間的平衡，且測定污染土壤中重金屬的可交換態含量時具有較高的準確性和靈敏度；在研究土壤/植物系統中重金屬的生物有效性時，較其他方法能提供更精確和更直接的信息[52]。但是此方法的前提假設是放射性同位素或穩定同位素可以100%用于交換，而不被土壤固定，且有足夠長的時間達到平衡[53]。

DMT、DGT、同位素稀釋法這3種方法雖然在不同的土壤環境下對重金屬生物有效性的研究具有較好的效果，但這些方法對設備和技術的要求較高，在我國應用并不廣泛。單級提取法是目前研究重金屬生物有效性合適且常用的方法，但受土壤環境的影響，提取劑在不同土壤中的提取效果不同，因此需要了解重金屬生物有效性的主要影響因素，從而為不同土壤環境中重金屬生物有效性的研究提供更好的分析方法。

2 土壤中重金屬生物有效性的影響因素

土壤中重金屬的生物有效性受多種因素的影響，主要有重金屬總量、土壤理化性質、施肥、根際環境等。這些因素的改變可能會將具有潛在生物有效性的重金屬轉化為生物有效態，也可能使重金屬固定或穩定于土壤中。因此，研究土壤中重金屬生物有效性的影響因素，對于控制、治理和修復重金屬對土壤環境的污染也具有重要意義。

2.1 重金屬總量

土壤中重金屬總量可以反映土壤受污染的情況，但重金屬的形態決定著潛在環境風險。研究有效態與總量的相關性，可以了解重金屬總量對生物有效性的影響。崔邢濤等[54]研究發現，重金屬總量對生物有效態有較大的影響，但不同的重金屬的生物有效態與總量的關系有較大差別，因此總量并不是影響重金屬生物有效性的唯一因素。

2.2 土壤理化性質

重金屬形態受土壤理化性質的影響比較敏感，主要包括pH、氧化還原電位(Eh)、有機質含量、黏粒含量等。

2.2.1 pH

土壤pH影響著重金屬的環境行為和生態效應，因此是影響重金屬生物有效性的重要因素之一。對于大多數重金屬，隨著pH的降低，重金屬在土壤溶液中的溶解性會增大，土壤對其吸附能力減弱，因此重金屬的生物有效性隨pH的降低而增強。于君寶等[55]研究發現，土壤pH降低0.5左右，有效態Cu含量約增加0.5～1.0倍，有效態Mn約增加3.0～5.0倍，有效態Zn約增加9.0～15.0倍。1982—1997年，太湖地區水稻土pH下降，土壤有效態重金屬含量明顯升高，水稻土pH與有效態Cu、Mn和Zn含量顯著負相關[56]。因此，土壤pH是影響重金屬生物有效性的重要因素。而以陰離子存在的As、Cr和V在酸性環境中的生物有效性變低，原因是pH降低使土壤顆粒所帶電荷由負變為正，增強了對陰離子的吸附能力。

2.2.2 Eh

通常情況下，Eh的升高會導致pH的降低[57]，從而增加重金屬的生物有效性。KELDERMAN等[58]研究發現，在沉積物Eh升高的過程中，Cu、Pb、Zn的可交換態和碳酸鹽結合態逐漸增加，因此其生物有效性也逐漸增強。由于變價陽離子金屬(Fe、Mn等)在低價時溶解性較高，因此隨著Eh的降低，其生物有效性增強；但當還原環境中有硫化氫時，會產生不溶解的金屬硫化物，從而降低其生物有效性。Cr(Ⅵ)的溶解性高于Cr(Ⅲ)，而As(Ⅲ)的溶解性卻高于As(Ⅴ)，因此Eh對變價陰離子金屬As和Cr的生物有效性有不同的影響。對于V生物有效性的研究，一些學者認為，在還原條件下，其他形態的V可轉化為可溶態V，增加了V的生物有效性[59]；但也有學者認為，在厭氧環境中，VO2+與土壤有機質形成穩定的絡合物固定在土壤中，降低了其生物有效性，在氧化環境中，V(Ⅲ)和V(Ⅳ)被氧化成V(Ⅴ)，其溶解性和遷移性增大[60-61]。

2.2.3 有機質含量

2.2.4 黏粒含量

在影響重金屬生物有效性的因素中，其影響順序依次為黏粒含量>pH>有機質含量>重金屬總量[65]。在重金屬污染的土壤中，重金屬容易受到比表面積較大，且對重金屬吸附能力較強的土壤黏粒吸附和固定。因此，黏粒較多的土壤，重金屬的生物有效性較低。SERRANO等[66]研究發現，提高土壤pH和黏粒含量，能有效地提高土壤對Cd和Pb的吸附量。此外，德國在規定有毒元素最高容許量時，根據黏粒含量的不同，規定了不同的容許量，土壤黏粒較多的情況下，有毒元素的容許量一般也較高[67]。

2.3 施 肥

已有研究表明，長期施用肥料會增加土壤中重金屬的含量[68-70]。由于重金屬的有效態含量與植物的吸收量呈顯著或極顯著正相關，因此一些學者研究了施肥對土壤中重金屬生物有效性的影響，其中化肥種類、施用量等均有重要影響[71]。由于一些化肥(尤其是磷肥)中重金屬含量較高，且化肥中重金屬的溶解性也較強，因此長期大量施肥不僅會增加土壤中重金屬的含量，其生物有效性也會增強。在長期不施用任何肥料或單施化肥的情況下，土壤中重金屬有效態的含量基本保持不變或降低[72]107,[73-74]。這可能是因為單施化肥促進了植物的生長，增加植物對重金屬的吸收量，也有可能是磷肥中的磷酸根促進了可溶態重金屬離子的沉淀，從而使土壤中有效態重金屬含量減少，而單施有機肥或化肥配施有機肥卻能顯著增加土壤中重金屬的生物有效態含量[72]107,[75]。有機肥施入土壤之后，發生分解產生的有機酸使土壤pH降低、還原性增強，從而促進重金屬的活化。

2.4 根際環境

植物在生長過程中會分泌出一些物質，統稱為根系分泌物，這些物質對重金屬形態的影響主要包括：酸化土壤，促進重金屬的溶解；與重金屬發生絡合作用；還原土壤中的重金屬。杜兵兵等[76]發現，從非根際土壤到根際土壤，總體上，具有生物有效性的Pb含量降低，而Pb的殘渣態含量增加，證明冬青科苦丁茶樹(IlexkudingchaC.J.Tseng)的根系分泌物將Pb活化之后，被植物吸收，降低了土壤中Pb的生物有效性。紫花苜蓿對重金屬具有耐受性，在污染土壤修復和治理方面應用較多，也有學者采用紫花苜蓿研究根際土壤和非根際土壤中V的生物有效性[77]，其中根際土壤中V的生物有效性更強，且隨著外源V的增加，根際土壤和非根際土壤中弱酸提取態、可還原態和可氧化態V含量顯著增加，而殘渣態V沒有明顯的變化，說明外源V進入土壤后并沒有轉化為殘渣態，而是向具有潛在生物有效性的形態轉化。

3 研究展望

目前，我國《土壤環境質量標準》(GB 15618—2008)采用不同土壤pH條件下重金屬的總量作為評價指標，而沒有提出重金屬生物有效性的評價標準，且沒有考慮其他環境條件。由于土壤環境的復雜性，重金屬通常以多種形態存在于土壤中，實際對環境造成危害或能被植物吸收的是具有生物有效性的重金屬。對于土壤中以生物有效態存在的重金屬，用總量作為評價標準具有一定的代表性，但總量并不能反映重金屬生物有效性不強時土壤的真實情況，且生物有效態重金屬比總量更能預測土壤與植物間重金屬的遷移累積。因此，一些學者建議，土壤環境質量標準的修訂應增加重金屬生物有效性作為評價指標，確定統一的重金屬生物有效性分析方法[78-79]。就目前的分析方法而言，單級提取法有操作簡單，提取時間短，提取效率高等優點，選擇合適的提取劑能較好指示土壤中重金屬生物有效性，是最常用的分析方法。同時建議深入研究不同土壤環境中各種重金屬適用的提取劑和提取方法，為方法的統一和標準的建立提供參考。

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Reviewonanalysismethodsofbioavailabilityofheavymetalsinsoilanditsinfluencefactors

YANGJie1,2,QUPan1,WANGJinsheng1,2,TENGYanguo1,2,ZUORui1,2.

(1.CollegeofWaterSciences,BeijingNormalUniversity,Beijing100875;2.EngineeringResearchCenterofGroundwaterPollutionandRemediation,MinistryofEducation,Beijing100875)

Soil environmental quality is related to food security and ecological security. Correct evaluation of soil environmental quality is particularly important and bioavailability of heavy metals is important for revealing the level of environmental pollution and evaluating ecological risk. The analysis methods of bioavailability of heavy metals in soil are the focus of research at home and abroad. The application of chemical extraction method,diffusive gradient in thin films technique(DGT),Donnan membrane technique(DMT) and isotope dilution method on bioavailability of heavy metals were introduced,and the main factors affecting bioavailability of heavy metals in soil were summarized,which would provide reference for the unity of analysis methods of heavy metal bioavailability.

soil; heavy metal; bioavailability; analysis method

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.02.021

2016-12-15)

楊 潔，女，1984年生，博士，講師，主要從事環境污染與防治方面的研究。#

。

*國家自然科學基金資助項目(No.41403085、No.41372233)。