新鐵炮百合朱麗葉器官差異基因表達分析

杜 方，王 婷，樊俊苗，張浩宇

(山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801)

新鐵炮百合朱麗葉器官差異基因表達分析

杜 方，王 婷，樊俊苗，張浩宇

(山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801)

為了探明17個候選基因在新鐵炮百合朱麗葉花、葉、鱗片3個器官中的表達情況，利用實時熒光定量PCR技術，對其相對表達量進行了研究。結果表明，根據表達情況，17個候選基因可以分為5類，CL10636.Contig1_All、CL6300.Contig2_All、CL7951. Contig5_All、 Unigene8314_All、Unigene19279_All和CL1306.Contig1_All 6個在花中顯著高表達，分別與糖轉運蛋白-類SWEET4基因、赤霉素調控蛋白基因、線粒體伴侶基因、光依賴性短下胚軸基因、1-脫氧葡萄糖-5-磷酸合成酶基因、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因高度同源；CL9292.Contig2_All、CL212.Contig5_All、Unigene1800_All、CL3468. Contig1_All、CL4520.Contig5_All、Unigene4212_All、CL4079.Contig1_All和Unigene10210_All 8個在葉中顯著高表達，分別與GDSL酯酶/脂酶基因、類黃酮O-甲基轉移酶、脂氫過氧化物裂解酶基因、4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸合成酶基因、多酚氧化酶基因、類葡苷露聚糖4-β-甘露糖轉移酶基因、左旋海松烷合成酶基因和反式羅勒烯合成酶基因高度同源；CL2405.Contig1_All在鱗片中顯著高表達，功能未知；CL1114.Contig2_All在花和葉中同時顯著高表達，與3-酮酯酰CoA-硫解酶高度同源；CL1772.Contig2_All為非器官差異表達基因，與Δ24-甾醇還原酶基因高度同源。此結果可為今后研究這些候選基因的功能奠定基礎，對百合分子育種具有重要意義。

百合；差異基因；實時熒光定量PCR；器官

百合是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)所有植物的統稱，其花朵碩大，色彩豐富，花姿優美，具有很高的觀賞價值和藥用價值[1]。百合的完整植株包括須根、鱗莖、花莖、葉片和花朵等器官，所有器官都來自于變態膨大的地下莖—鱗莖的鱗莖盤，這使得百合器官的起源變得十分有趣。

早期，對器官發生相關基因的研究主要是基于突變體庫的建立，利用擬南芥模式系統，科學家對植物根、莖、葉、花等各器官的形態建成進行了研究，花發育的ABC模型是其中最重要的發現之一。后來，對矮牽牛胚珠發育和擬南芥花發育的深入研究，導致了花發育ABCDE模型的確認[2-3]。同時，對水稻[4]、人參[5]和大豆[6]等器官發育基因的研究，正推動著器官發育生物學的全面發展。

然而，對突變體進行篩選費時費力，該方法不適用于基因組特別大的物種(如百合，36 Gb)。近幾年，隨著測序技術的快速發展，可以在較短的時間內找到不同品種、不同器官或不同試驗處理間的差異基因，為百合的分子生物學研究提供了發展機遇。近3年來，利用Illumina測序平臺發展起來的數字基因表達譜技術，有學者深入挖掘了百合春化[7]、脅迫[8]、碳代謝[9]、矮化[10]、花粉萌發[11]、花發育[12-13]和花色生物合成[14]相關的基因。

為了開發百合的分子標記，山西農業大學園藝學院百合課題組利用Illumina測序平臺構建了東方百合索邦(Sorbonne)根、鱗莖、莖皮、葉片、花瓣和柱頭6種器官混合樣的轉錄組數據庫[15]；在此基礎上，又構建了東方百合索邦花、葉、鱗片3個器官的數字基因表達譜，找出了在索邦器官中差異表達的基因[16]。然而，基因的表達水平可能隨品種和植株的發育時期而變化。朱麗葉是新鐵炮百合系列的一個品種，花白色、長筒形，朝天開放，易于種子繁殖；與粉色、碟形花、花朵斜向開放的東方百合索邦完全不同。

為了探明在索邦花、葉、鱗片中差異表達的基因在朱麗葉中的表達情況，本研究利用實時熒光定量PCR(qPCR)對17個在索邦花、葉、鱗莖中差異表達的基因在朱麗葉中的表達進行了研究，以期為今后研究這些候選基因的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1試驗材料

新鐵炮百合朱麗葉(LiliumformolongiJulius)，購于浙江虹越花卉有限公司，2015年4月栽植于山西農業大學園藝站，2015年7月開花，挖取剛開放的3株百合完整植株于實驗室，分取5 cm長花蕾、頂端葉片(L)和內層鱗片(S)，撕成小塊后快速儲藏于-80 ℃冰箱。

1.2試驗方法

1.2.1 總RNA提取與反轉錄 RNA的提取根據GenStar公司的TRIGene 總RNA提取試劑盒說明書進行，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，用MONODROP 2000c生物光度計檢測RNA濃度和純度，質量合格的RNA保存于-80 ℃超低溫冰箱。

按照GenStar公司的StarScript Ⅱ cDNA 第1鏈合成試劑盒說明書反轉錄cDNA，將得到的cDNA溶液稀釋至100 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 引物設計 基因序列來源于山西農業大學園藝學院百合課題組前期所構建的百合轉錄組數據庫L.-Unigene-All[15]，采用Primer 3(http：//primer 3.ut.ee/)在線設計引物(表1)，交由生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 實時熒光定量PCR 采用熒光染料法，以18S rRNA為內參基因(正向引物5′-CGCAAGGCTGAAACTTA

AAGG-3′；反向引物5′-CAGACAAATCGCTCCACCAAC-3′)，利用TaKaRa公司 q-PCR試劑盒配置20 μL反應體系，包括 SYBR Ⅱ 10 μL，雙蒸水 7 μL，cDNA 1 μL，Primer 1.6 μL，ROX 0.4 μL。在7500 Real time PCR System上運行qRT-PCR試驗，每個樣本重復3次。反應程序如下：95 ℃ 3 min；之后94 ℃ 30 s ，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(熒光)，共40個循環。溶解曲線條件為95 ℃ 15 s，54 ℃ 1 min，從54 ℃每30 s上升0.4 ℃直到95 ℃，95 ℃ 30 s(熒光)，54 ℃ 15 s。

1.3數據統計

采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，采用SPSS和LSD法進行統計分析及多重比較，利用Excel 2003繪圖。

2 結果與分析

2.1總RNA提取

使用生物光度計檢測各樣品RNA質量，各組織總RNA的OD260/280值均在1.8～2.0。取4 μL 總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統成像如圖1所示。相對而言，朱麗葉百合鱗片的RNA較難提取，提取濃度較低，但可以滿足試驗需求。

2.2花中的高表達基因

實時熒光定量PCR的結果表明，CL10636.Contig1_All、CL6300.Contig2_All、CL7951.Contig5_All、 Unigene8314_All 等4個轉錄本在朱麗葉百合花器官中的表達量顯著高于在葉和鱗片中的表達量(P<0.05)，且在葉片和鱗片中的表達量差異不顯著。Unigene19279_All(7)和CL1306.Contig1_All(17)除在朱麗葉花中有顯著高的表達量外，在葉中也有一定的表達量，顯著低于花中的表達量，但顯著高于鱗片中的表達量(P<0.05)(圖2)。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

注：F.正向引物；R.反向引物。

Note：F. Forward primer；R. Reverse primer.

F. 花；L.葉；S.鱗片；M.DL2000 Marker。圖2-6同。F.Flower；L.Leaf；S.Scale;M.DL2000 Marker. The same as Fig.2-6.

2.3葉中的高表達基因

圖3結果顯示，CL9292.Contig2_All、CL212.Contig5_All、Unigene1800_All、CL3468. Contig1_All、CL4520.Contig5_All、Unigene4212_All 6個基因在朱麗葉葉器官中的表達量顯著高于在花和鱗片中的表達量(P<0.05)，且在葉和鱗片中的表達量差異不顯著。CL4079.Contig1_All和Unigene10210_All在朱麗葉葉器官中的表達量顯著高于在花和鱗片中的表達量，但花和鱗片中的表達量存在顯著差異(P<0.05)。其中，CL4079.Contig1_All(15)在朱麗葉花中的表達量顯著高于鱗片中的表達量，而Unigene10210_All(16)在朱麗葉鱗片中的表達量顯著高于在花中的表達量(P<0.05)。

2.4鱗片中的高表達基因

僅CL2405.Contig1_All在朱麗葉鱗片中的表達量顯著高于在花和葉中的表達量(P<0.05)，且在花和葉中的表達量差異不顯著(圖4)。

1.CL10636.Contig1_All ；5.CL6300.Contig2_All ；6.CL7951.Contig5_All ；7.Unigene19279_All ；12.Unigene8314_All ；17.CL1306.Contig1_All。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3-6同。1.CL10636.Contig1_All；5.CL6300.Contig2_All；6.CL7951.Contig5_All；7.Unigene19279_All；12.Unigene8314_All；17.CL1306.Contig1_All；Different lowercase mean significant difference at 0.05 level.The same as Tab.3-6..

2.CL9292.Contig2_All；4.CL212.Contig5_All；8. Unigene1800_All；10.CL3468.Contig1_All；13.CL4520.Contig5_All；14.Unigene4212_All；15.CL4079.Contig1_All；16.Unigene10210_All。

圖4 朱麗葉百合鱗片中高表達的基因Fig. 4 Highly expressed genes in scales

2.5花、葉中均高表達的基因

轉錄本CL1114.Contig2_All在朱麗葉花和葉器官中的表達量差異不顯著，但均顯著高于在鱗莖中的表達量(P<0.05)(圖5)。

2.6非器官差異表達基因

轉錄本CL1772.Contig2_All在朱麗葉花、葉、鱗片中均表達，但差異不顯著(圖6)。

圖5 朱麗葉百合花和葉中高表達的基因Fig.5 Highly expressed genes in flowers and leaves

圖6 朱麗葉百合的非器官差異表達基因Fig.6 Insignificant expressed genes in flowers，leaves and scales

3 討論

實時熒光定量PCR(qPCR)是一種快速、特異地檢測單個基因表達變化的方法，現已在基礎科學研究、食品安全檢測、藥物研發、海關檢驗檢疫等科研和實踐領域得到廣泛應用[17]。本研究應用此項技術，將17個基因在朱麗葉3個器官中的表達情況分為5類，即在花中顯著高表達的基因、在葉中顯著高表達的基因、在鱗片中顯著高表達的基因、在花和葉中同時顯著高表達的基因和非器官差異表達基因。

供試轉錄本中有6個轉錄本在花朵中顯著高表達，它們分別與糖轉運蛋白-類SWEET4基因、赤霉素調控蛋白基因、線粒體伴侶基因、光依賴性短下胚軸基因、1-脫氧葡萄糖-5-磷酸合成酶基因、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因高度同源。SWEET蛋白起蔗糖轉運體的作用，在植物體中常與育性有關[18]。線粒體伴侶蛋白對于線粒體電子傳遞復合物Ⅲ的組裝必不可少[19]，光依賴性短下胚軸基因在擬南芥的花和葉的邊界細胞(Boundary cells)中被檢測到[20]，它們可能與花朵開放過程中能量的供應和形態發生有關。1-脫氧葡萄糖-5-磷酸合成酶基因和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因均是萜類代謝途徑中2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑的重要基因，可能與花香的形成有關[21]。

有8個轉錄本在葉片中高表達，它們分別與GDSL酯酶/脂酶基因、類黃酮O-甲基轉移酶、脂氫過氧化物裂解酶基因、4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸合成酶基因、多酚氧化酶基因、類葡苷露聚糖4-β-甘露糖轉移酶基因、左旋海松烷合成酶基因和反式羅勒烯合成酶基因高度同源。其中，GDSL酯酶/脂酶已在多種植物中證明參與植物的生長發育和形態建成[22]。左旋海松烷合成酶和類黃酮O-甲基轉移酶被發現在多種植物中具有防御病蟲害的功能[23-26]，4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸合成酶基因和反式羅勒烯合成酶基因也是MEP途徑中的重要基因，在多種植物的葉片和根中被克隆[27-28]。本試驗發現，反式羅勒烯合成酶基因在朱麗葉花中也有少量表達，說明萜烯類是多種植物多種器官重要的次生代謝產物。多酚氧化酶是植物體內普遍存在的一類銅結合酶，主要存在于正常的光合組織內[29]。脂氫過氧化物裂解酶基因是脂氧合酶下游的一個關鍵性酶，與植物抗病蟲、老化等生理進程有關[30]。也有試驗證明，脂氫過氧化物裂解酶基因催化脂氫過氧化物裂解產生具有特異芳香氣味的物質，在濃香型東方百合桑坦德中的表達量是香味稍差的東方百合和喇叭百合雜交種巴拉多納的3倍[31]，表明不同品種中該基因的表達水平不一樣。本試驗中的朱麗葉為清香型百合，該基因在花中的表達量顯著低于在葉片中的表達量。

轉錄本CL1772.Contig2_All參與類固醇代謝，是與Δ24-甾醇還原酶基因高度同源的基因。甾醇存在于高等植物的細胞膜、細胞質和細胞器內，是調節細胞膜流動性與通透性的關鍵脂質成分，對植物生長發育有重要作用[32]。該基因屬于管家基因，不具有器官特異性，這與該基因在朱麗葉花、葉、鱗片3個器官的表達特征無顯著差異相一致。轉錄本CL1114.Contig2_All是與3-酮酯酰CoA-硫解酶高度同源的基因，參與脂質的代謝活動，催化β氧化循環中的硫解反應[33]，而β氧化循環是個放能的過程，該基因在朱麗葉花和葉中高表達，暗示著剛剛開花的百合植株的地上部正進行著旺盛的生命活動。

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AnalysisofDifferentiallyExpressedGenesinOrgansofLiliumformolongiJulius

DU Fang，WANG Ting，FAN Junmiao，ZHANG Haoyu

(College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China)

To understand the expression levels of 17 candidate genes in flower，leaf and scale ofLiliumformolongiJilius，Real time quantitative PCR was conducted. The results showed that the 17 candidate genes could be divided into five groups.CL10636.Contig1_All，CL6300.Contig2_All，CL7951. Contig5_All，Unigene8314_All，Unigene19279_All and CL1306.Contig1_All significantly highly expressed in flowers，which were highly homologous with Bidirectional sugar transporter SWEET4-like gene，cold-regulated gibberellin-regulated protein gene bidirectional，mitochondrial chaperone gene，Lightlight-dependent short hypocotyls 4-like gene，1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase gene，geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene. CL9292.Contig2_All，CL212.Contig5_All，Unigene1800_All，CL3468. Contig1_All，CL4520.Contig5_All，Unigene4212_All，CL4079.Contig1_All and Unigene10210_All eight significantly highly expressed in leaves，which were highly homologous with GDSL esterase/lipase gene，flavonoid O-methyltransferase gene，hydroperoxide lyase gene，4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate gene，polyphenol oxidase gene，glucomannan 4-beta-mannosyltransferase 1-like gene，Levopimaradiene synthase gene and trans-ocimene synthase gene. CL2405.Contig1_All significantly highly expressed in scales，function unknown. CL1114.Contig2_All significantly highly expressed in both flowers and leaves，highly homologous with 3-ketoacyl-CoA thiolase gene. CL1772.Contig2_All，homologous with delta-(24)-sterol reductase，was non-organ specific gene. The results are valuable for the functional study of those genes and will be benefit for the molecular breeding of lily.

Lily；Differentially expressed genes；Real-time q-PCR；Organs

2017-05-02

山西省應用基礎研究項目(201601D011077)；山西農業大學引進人才科研啟動項目(2014ZZ02)

杜 方(1973-)，女，山西原平人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事花卉種質資源創新及生物技術應用研究。

S682.29；Q78

A

1000-7091(2017)05-0025-06

10.7668/hbnxb.2017.05.005