馬鈴薯擴展蛋白基因家族的鑒定與表達分析

理向陽，代丹丹，楊鐵鋼，郝 西

(河南省農業科學院 經濟作物研究所，河南 鄭州 450002)

馬鈴薯擴展蛋白基因家族的鑒定與表達分析

理向陽，代丹丹，楊鐵鋼，郝 西

(河南省農業科學院 經濟作物研究所，河南 鄭州 450002)

為了分析馬鈴薯擴展蛋白基因家族的進化與功能，鑒定了馬鈴薯的擴展蛋白基因家族，分析了其基因結構特征、系統發育及表達模式等。結果表明，馬鈴薯基因組包含33個擴展蛋白基因，包括A (21)、B (5)、LA (1)和LB (6) 4個亞家族，分布在馬鈴薯11條染色體上。擴展蛋白氨基酸長度為194～488 aa，編碼蛋白質具有保守的結構域，蛋白質亞細胞定位預測結果表明所有蛋白均定位于細胞外。基因結構分析表明，馬鈴薯擴展蛋白家族有23個基因(69.7%)含有2～3個內含子。基因表達分析發現，該家族基因在馬鈴薯根、莖、匍匐莖、果實及塊莖發育過程中表達豐度較高，并且其表達受到高溫、鹽、激素及病害等逆境的調控。

馬鈴薯；擴展蛋白；生物信息學；基因家族

擴展蛋白(Expansins)是植物細胞壁的重要組成部分，通過引起細胞壁組分間的松馳和細胞壁柔韌性增加，參與植物的許多生長發育過程[1]。1992年，Mcqueen-Mason等[2]首次從黃瓜胚軸中分離出擴展蛋白。隨著植物基因組測序工作的開展，燕麥[3]、番茄[4]、玉米[5]、大豆[6]和黃瓜[7]等物種的擴展蛋白基因已經完成了全基因組鑒定。按照進化關系，擴展蛋白分為4個亞家族：EXPA、EXPB、EXLA和EXLB (也稱α、β、γ和δ亞家族)[8]。擴展蛋白的長度一般為205～275個氨基酸，大多數在氨基末端含有一個信號肽，長度為20～30個氨基酸[9]。研究表明，擴展蛋白在植物的多個生理過程中發揮重要功能，比如水果成熟軟化[10]、木質部形成[11]、葉片脫落[12]、種子發芽[13]和花粉管伸長[14-15]、根毛的起始和伸長[16-17]、棉花纖維發育[18-19]、抗逆[20-21]等，擴展蛋白基因的進化與功能研究已成為國內外的研究熱點之一。

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界上最重要的非谷物類糧食作物，據統計2009年全球馬鈴薯產量約為3.3億t[22]。其中我國馬鈴薯種植面積2009年達到508.30萬hm2，總產量為7 328.19萬t，種植面積和總產量均居世界第1位，種植范圍遍及全國[23]。馬鈴薯基因組測序計劃的完成[24]，為深入研究該物種擴展蛋白家族的進化和其他特征提供了充足的數據資源。本研究依據已發表的馬鈴薯全基因組測序數據，鑒定馬鈴薯擴展蛋白基因家族成員33個，并分析了其染色體分布、基因結構、組織表達模式等生物學信息，以期為進一步開展該基因家族的功能和進化研究提供參考。

1 材料和方法

1.1馬鈴薯expansin基因家族的鑒定

擬南芥和水稻expansin家族的基因和蛋白序列分別從TAIR網站(http：//arabidopsis.org/)和RGP網站(http：//rapdb.dna.affrc.go.jp)下載。利用下載的擬南芥和水稻expansin蛋白序列，分別比對PHYTOZOME v11 database (www.phytozome.net/)中的馬鈴薯預測(Solanumtuberosumv3.4)，滿足E-value≤-10的序列被作為候選序列；最后利用Smart(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Pfam(http：//pfam.xfam.org/search)網站預測這些候選序列是否同時存在PF03330和PF01357結構域。番茄expansin家族基因序列從PHYTOZOME v11 database (www.phytozome.net)下載。

1.2馬鈴薯expansin基因家族蛋白特征分析

利用ProtParam tool在線工具(http：//web.expasy.org/protparam)分析每個馬鈴薯擴展蛋白的分子量、等電點等參數；分別利用CELLO v2.5 server (http：//cello.life.nctu.edu.tw)和Euk-mPLoc 2.0(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk/multi-2/#)進行蛋白的亞細胞定位預測。

1.3馬鈴薯expansin基因家族的染色體定位與基因結構分析

從PHYTOZOME數據庫中獲得33個馬鈴薯擴展蛋白基因的注釋信息，進行染色體定位；利用Gene Structure Display Server在線工具(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析每個基因的結構。

1.4馬鈴薯expansin基因的保守motif分析

利用MEME(multiple expectation maximization for motif elicitation)在線分析工具(http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)預測馬鈴薯expansin的保守motif。利用此軟件分析時，最大模體數量(Maximum number of motifs)設為10，其他參數默認。

1.5馬鈴薯expansin家族基因的進化分析

首先利用Clustal X2程序進行多序列比對分析，再使用MEGA 5.1軟件對序列比對結果生成系統發育樹(Bootstrap值設置為1 000，其他參數為默認值)。

1.6馬鈴薯expansin基因家族的表達模式分析

利用已發表的馬鈴薯轉錄組測序數據分析基因的表達特征[24]。該轉錄數據包含不同組織及生物和非生物脅迫下的基因表達數據。轉錄本數據通過取對數(log2)轉換，利用Genesis軟件作熱圖。

2 結果與分析

2.1馬鈴薯擴展蛋白基因家族的篩選

通過Blastp比對，從馬鈴薯基因組數據庫中共獲得77個擴展蛋白候選基因，進一步通過Pfam和Smart在線軟件剔除不含擴展蛋白保守結構域的序列，最終鑒定出33個馬鈴薯擴展蛋白基因(表1)。33個馬鈴薯擴展蛋白基因分為EXPA、EXPB、EXLA和EXLB 4個亞家族，其中EXPA亞家族數目最多為21個，EXPB、EXLA和EXLB 3個亞家族基因數目分別為5，1，6個。馬鈴薯擴展蛋白基因數目相比擬南芥少2個，分別是擬南芥(35)、水稻(56)、大豆(49)、蘋果(34)、菜豆(25)的0.94,0.59,0.67,0.97,1.32倍(表2)。馬鈴薯與其近緣物種番茄相比總擴展蛋白基因數目少5個，二者EXLA亞家族基因數目均為1個。

馬鈴薯33個擴展蛋白基因的蛋白分子質量從20.75 kDa到54.49 kDa不等，等電點最小值為4.68，最大為9.87；其蛋白氨基酸殘基的長度為194～488，平均值為272，跨度較大。其中19個(占57.6%)蛋白序列中含有長度為17～26個氨基酸的信號肽。

分別利用CELLO v2.5 server和Euk-mPLoc localization在線工具進行擴展蛋白的亞細胞定位預測。根據Euk-mPLoc軟件預測，33個馬鈴薯擴展蛋白均定位于細胞外；從CELLO v2.5 server軟件分析結果看，30個蛋白(占90.9%)定位于細胞外，2個蛋白(StEXPA4和StEXPB4)同時定位于細胞外和質膜，1個蛋白(StEXLB1)同時定位于細胞質、線粒體和細胞核。

表1 馬鈴薯擴展蛋白基因家族基本信息Tab.1 Identification of expansin gene family members from potato

表2 不同植物擴展蛋白亞家族數目分析Tab.2 Sizes of the four expansin subfamilies in different plants

2.2馬鈴薯擴展蛋白基因家族的染色體定位

利用擴展蛋白基因在染色體上的物理位置信息，分別把33個馬鈴薯擴展蛋白基因定位于11條染色體上(第11號染色體除外)，并且33個基因在11條染色體上的分布是不均衡的(圖1)；其中8號染色體含有最多的基因(7個)，3，6號染色體含4個基因，1，7，10號染色體包含3個基因，2，5，9，12號染色體含2個基因，4號染色體含1個基因，11號染色體上不含基因。與近緣物種番茄相比，馬鈴薯和番茄均是11號染色體上不含擴展蛋白基因；所不同的是，番茄3號染色體含有最多的基因(9個)，而馬鈴薯則是8號染色體含有最多的擴展蛋白基因(7個)。

圖1 馬鈴薯擴展蛋白基因的染色體定位Fig.1 Chromosome distribution of potato expansin genes

2.3馬鈴薯擴展蛋白基因結構分析

通過馬鈴薯擴展蛋白基因的內含子外顯子結構分析，發現其含有的內含子較少(表1、圖2)，平均為2.4個；其中6個基因(18.2%)含有1個內含子，23個基因(69.7%)含有2～3個內含子，4個基因(12.1%)含有3個以上的內含子。馬鈴薯擴展蛋白4個亞家族的平均內含子數目分別為A類1.8個，B類3.6個，LA類4.0個和LB類3.3個。

圖2 馬鈴薯擴展蛋白基因的進化與結構分析Fig.2 Phylogenetic and structural analysis of expansin genes of potato

通過MEM軟件在線分析，發現每個馬鈴薯擴展蛋白基因含有4～9個motif。4個亞家族均含有motif 3和motif 6；除了StEXPB4外，EXPA、EXPB 2個亞家族均含有motif 1；除了StEXPA1外，EXPA亞家族均含有motif 2、motif 4和motif 7。除了StEXPB5，EXPB、EXLA和EXLB亞家族均含有motif 8和motif 9。EXLA和EXLB亞家族均含有motif 10。

從圖2可以看出，同一亞家族內的擴展蛋白基因含有保守的內含子外顯子結構和motif特征，而不同亞家族之間則差異較大。

2.4馬鈴薯擴展蛋白家族的系統發育樹分析

為了分析33個馬鈴薯擴展蛋白家族成員之間的進化關系，利用Mega 5程序構建了該家族蛋白的系統發育樹。結果表明，33個擴展蛋白被劃分為EXPA、EXPB、EXLA、EXLB 4個亞家族(圖2)。從系統發育樹共發現12個同源基因對，其中9個同源基因對的步長值90%，8個同源基因對的步長值為100%；在12個同源基因對中，5個姐妹基因對間有80%～86%的蛋白序列相似性，4個姐妹基因對具有75%～79%的蛋白序列相似性，2個姐妹基因對具有71%～73%的蛋白序列相似性，1個姐妹基因對具有53%的蛋白序列相似性。

馬鈴薯與番茄同屬茄科，親緣關系較近，為研究二者擴展蛋白家族之間的進化關系，利用33個馬鈴薯擴展蛋白和38個番茄擴展蛋白的氨基酸序列構建了系統發育樹(圖3)。從系統發育樹可知，71個擴展蛋白基因被明顯分為4個亞家族，并且具有較高的相似性。共鑒定物種間的直系同源蛋白29對，其中有27對直系同源蛋白間的步長值為100%；而物種內的旁系同源蛋白數目為0。

圖3 馬鈴薯與番茄的系統發育樹分析Fig.3 The phylogenetic tree of potato and tomato expansin family

2.5馬鈴薯擴展蛋白家族成員表達模式

下載已發表的馬鈴薯15個組織的轉錄組數據[24]，找到33個擴展蛋白基因對應轉錄本的RPKM值，先進行對數值轉換(log2)，然后利用Genesis軟件作熱圖(圖4-A)。圖中深灰色代表基因表達豐度較高，淺灰色代表基因表達水平較低。由圖4-A可知，有11個擴展蛋白基因在15個組織中都表達(占33.3%)；19個基因在10種以上組織表達(占57.6%)；有14個基因在10種以下組織中表達(占42.4%)，未發現具有組織特異性表達特點的擴展蛋白基因。此外，StEXPA14、StEXPA17和StEXLA1這3個基因在所有的15個組織均有較高的表達量，StEXPA19和StEXPA21 2個基因在所有的15個組織表達量均很低；共有23個基因在塊莖中表達，其中5個基因(StEXPA9、StEXPA12、StEXPA14、StEXLA1和StEXLB6)在塊莖中的表達量非常高。

A.在不同組織或器官中的表達；B．不同激素或脅迫條件下的誘導表達情況。A.Expression within different tissues or organs; B.Induced expression by different plant hormones or stress.

33個馬鈴薯擴展蛋白基因在35 ℃高溫、甘露醇(260 μmol/L)、鹽(150 μmol/L NaCl)、激素誘導(50 μmol/L 赤霉素、10 μmol/L生長素、50 μmol/L脫落酸和10 μmol/L細胞分裂素)及生物脅迫(初生組織損傷、次生組織損傷、晚疫病菌侵染、2 mg/mL β-氨基丁酸、100 mg/mL二叔丁對甲酚)條件下的表達如圖4-B所示。在鹽和甘露醇脅迫誘導下，StEXPA10均顯著上調表達；高溫脅迫下，StEXPA15和StEXLB5顯著上調表達；在高溫和脫落酸脅迫下，StEXLB5均顯著上調表達，而StEXPA8和StEXPA11均顯著下調表達；在脫落酸、生長素和赤霉素誘導下，StEXLB1均表現為顯著上調表達。在BAP誘導下，除StEXPA10、StEXPA16和StEXPB5這3個基因上調外，其余基因的表達多表現為下調。StEXPA1和StEXPB2在所有脅迫條件下RPKM值均為0。在脫落酸誘導下，除StEXLB3基因下調外，其余5個EXLB亞家族基因的表達一致表現為顯著上調；StEXLB3和StEXLB4的表達同時受到細胞分裂素、初生組織損傷、次生組織損傷3種脅迫誘導的顯著抑制；在初生組織損傷和次生組織損傷2種條件下，多數基因均上調表達，其中StEXPA3、StEXPA7、StEXPA8、StEXPA9和StEXPA11均顯著受到初生組織損傷和次生組織損傷2種脅迫誘導條件的顯著誘導上調表達；在初生組織損傷誘導下，除StEXLB4基因外，其余5個EXLB亞家族基因的表達一致，表現為顯著下調；在晚疫病菌侵染侵染脅迫下，StEXLB2和StEXLB5均表現為顯著下調表達。

3 結論與討論

擴展蛋白廣泛存在于植物基因組中，主要參與細胞擴張和一系列發生細胞壁修飾的發育過程。本研究共鑒定出馬鈴薯擴展蛋白家族基因33個，包含4個亞家族；不同亞家族之間在基因內含子外顯子結構、motif模式等方面具有一定的保守性，代表了亞家族的重要特征。23個擴展蛋白基因(69.7%)含有2～3個內含子；EXPA、EXPB、EXLA和EXLB 4個亞家族均含有motif 3和motif 6；除了StEXPB5，EXPB、EXLA和EXLB亞家族均含有motif 8和motif 9。相比EXPA和EXPB，EXLA和EXLB 2個亞家族特異含有motif 10。同一亞家族內的擴展蛋白基因含有保守的內含子與外顯子結構和motif特征，而不同亞家族之間motif的多樣化也表明了馬鈴薯擴展蛋白基因廣泛參與細胞內的多種代謝途徑和反應。

擴展蛋白在馬鈴薯許多生長發育過程中發揮重要功能。通過分析已發表的馬鈴薯公共轉錄組數據，發現19個StExp基因在10種以上組織表達(占57.6%)，未發現組織特異性表達的StExp基因；共有23個基因在塊莖中表達(占69.7%)，其中5個基因(StEXPA9、StEXPA12、StEXPA14、StEXLA1和StEXLB6)在塊莖中的表達量非常高。由于擴展蛋白基因與馬鈴薯塊莖膨大過程關系密切[25-26]，今后可以通過構建特異的突變體或轉基因等手段來研究擴展蛋白基因的功能，并探討通過轉基因技術調控馬鈴薯塊莖膨大的可行性。

激素和脅迫處理的轉錄數據分析表明，94%的馬鈴薯擴展蛋白基因(31/33)都受到一種或多種脅迫條件的顯著誘導或抑制。StEXPA8和StEXPA11的表達受到初生組織損傷、次生組織損傷和二叔丁對甲酚的顯著誘導，但在高溫、脫落酸、細胞分裂素和β-氨基丁酸處理下均明顯下調；StEXLB1的表達受到脫落酸、生長素和赤霉素3種激素的顯著誘導，但在初生組織和次生組織損傷、晚期病菌侵染和β-氨基丁酸處理條件下均表現為下調；StEXLB6的表達受到脫落酸和β-氨基丁酸的顯著誘導，但在高溫、初生組織損傷和二叔丁對甲酚處理條件下均表現為下調。這些結果表明馬鈴薯擴展蛋白基因在激素和逆境脅迫響應過程中具有重要功能。

植物擴展蛋白基因功能已成為近年來的研究熱點之一，但是有關馬鈴薯擴展蛋白基因的全基因組鑒定尚未見報道。本研究基于馬鈴薯全基因組測序數據，鑒定了33個擴展蛋白基因，并對其基因結構、進化與表達模式等進行了初步分析，將為開展該基因家族的深入研究提供參考。

[1] Cosgrove D J，Li L C，Cho H T，et al. The growing world of expansins[J]. Plant and Cell Physiology，2002，43(12)：1436-1444.

[2] Mcqueen-Mason S，Durachko D M，Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants[J]. The Plant Cell，1992，4(11)：1425-1433.

[3] Li Z C，Durachko D M，Cosgrove D J. An oat coleoptile wall protein that induces wall extension in vitro and that is antigenically related to a similar protein from cucumber hypocotyls[J]. Planta，1993，191(3)：349-356.

[4] Keller E，Cosgrove D J. Expansins in growing tomato leaves[J]. Plant Journal，1995，8(6)：795-802.

[5] Wu Y，Sharp R E，Durachko D M，et al. Growth maintenance of the maize primary root at low water potentials involves increases in cell-wall extension properties，expansin activity，and wall susceptibility to expansins[J]. Plant Physiology，1996，111(3)：765-772.

[6] Zhu Y，Wu N N，Song W L，et al. Soybean (glycine max) expansin gene superfamily origins：segmental and tandem duplication events followed by divergent selection among subfamilies[J]. BMC Plant Biology，2014，14：93.

[7] 郝 西，理向陽，臘貴曉，等. 黃瓜擴展蛋白基因家族的鑒定與生物信息學分析[J]. 分子植物育種，2015，13(10)：2280-2289.

[8] Kende H，Bradford K，Brummell D，et al. Nomenclature for members of the expansin superfamily of genes and proteins[J]. Plant Molecular Biology，2004，55(3)：311-314.

[9] Sampedro J，Cosgrove D J. The expansin superfamily[J]. Genome Biology，2005，6(12)：12.

[10] Cosgrove D J. Loosening of plant cell walls by expansins[J]. Nature，2000，407(6802)：321-326.

[11] Gray-Mitsumune M，Mellerowicz E J，Abe H，et al. Expansins abundantin secondary xylem belong to subgroup A of the α-expansin gene family[J]. Plant Physiology，2004，135(3)：1552-1564.

[12] Belfield E J，Ruperti B，Roberts J A，et al. Changes in expansin activity and gene expression during ethylene-promoted leaflet abscission inSambucusnigra[J]. Journal of Experimental Botany，2005，56(413)：817-823.

[13] Chen F，Bradford K J. Expression of an expansin is associated with endosperm weakening during tomato seed germination[J].Plant Physiol,2000，124(3)：1265-1274.

[14] Cosgrove D J，Bedinger P，Durachko D M. Group Ⅰ allergens of grass pollen as cell wall-loosening agents[J]. Proc Natl Acad Sci，1997，94(12)：6559-6564.

[15] Pezzotti M，Feron R，Mariani C. Pollination modulates expression of the PPAL gene，a pistil-specific β-expansin[J]. Plant Molecular Biology，2002，49(2)：187-197.

[16] Yu Z M，Kang B，He X W，et al. Root hair-specific expansins modulate root hair elongation in rice[J]. Plant Journal，2011，66(5)：725-734.

[17] Guo W B，Zhao J，Li X X，et al. A soybean beta-expansin geneGmEXPB2 intrinsically involved in root system architecture responses to abiotic stresses[J]. Plant Journal，2011，66(3)：541-552.

[18] 李曉東，李 波，范 玲. 基因工程改良棉花纖維品質研究進展[J]. 生物技術通報，2012(10)：8-14.

[19] An C F，Saha S，Jenkins J N，et al. Transcriptome profiling，sequence characterization，and SNP-based chromosomal assignment of the EXPANSIN genes in cotton[J]. Molecular Genetics and Genomics，2007，278(5)：539-553.

[20] Han Y Y，Li A X，Li F，et al. Characterization of a wheat (TriticumaestivumL.) expansin gene，TaEXPB23，involved in the abiotic stress response and phytohormone regulation[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2012，54：49-58.

[21] Zhao M R，Han Y Y，Feng Y N，et al. Expansins are involeved in cell growth mediated by abscisic acid and indole-3-acetic acid under drought stress in wheat[J]. Plant Cell Reports，2012，31(4)：671-685.

[22] Florian J，Leighton P，Graham J E，et al. Identification and localisation of the NB-LRR gene family within the potato genome [J]. BMC Genomics，2012，13：75.

[23] 賈晶霞，楊德秋，李建東，等. 中國與世界馬鈴薯生產概況對比分析與研究[J]. 農業工程，2011，1(2)：84-86.

[24] Xu X，Pan S，Cheng S,et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato[J]. Nature，2011，475(7355)：189-195.

[25] 毛彥芝. 番茄和馬鈴薯擴展蛋白研究進展[J]. 黑龍江八一農墾大學學報，2013，25(5)：5-8，47.

[26] Jieun J，Erin M O D，Paul P D，et al. Expression of multiple expansin genes is associated with cell expansion in potato organs [J]. Plant Science，2010，179：77-85.

Genome-wideIdentificationandExpressionAnalysisoftheExpansinGeneFamilyinPotato

LI Xiangyang，DAI Dandan，YANG Tiegang，HAO Xi

(Industrial Crop Institute，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China)

As an important component of plant cell wall，expansins have effects on loosening and increasing the flexibility of cell wall，and are thought to have function in many process of plant growth. To study potential function of expansin gene family in potato，we investigated expansin gene family with the whole genome database to analyse its structure，phylogenetic relationship and expression profiles. Potato genome contained 33 expansin genes which belonged to 4 subfamilies (EXPA (21)，EXPB (5)，EXLA (1) and EXLB (6)) located on 11 different chromosomes. Expansin proteins ranged from 194 aa to 488 aa in size and had conserved domains. All 33 Expansin proteins were predicted to localize in extracellular. Gene structure analysis revealed that seventy percent(23/33) expansin genes had 2-3 introns. Transcriptome analysis showed that the potato expansin genes expressed highly in root，stem，stolon，mature fruit and tuber.

Potato；Expansin；Bioinformatics；Gene family

2017-07-02

河南省農業科學院自主創新項目(2016ZZ20)

理向陽(1975-)，男，河南西華人，助理研究員，主要從事作物生理與分子生物學研究。

郝 西(1979-)，男，河南平頂山人，副研究員，博士，主要從事作物生理研究。

Q78

A

1000-7091(2017)05-0037-08

10.7668/hbnxb.2017.05.007