紫蘇PfDGAT2基因生物信息學(xué)及表達(dá)特性分析

梁 倩，李 璐，周雅莉，安 茜，王計(jì)平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

紫蘇PfDGAT2基因生物信息學(xué)及表達(dá)特性分析

梁 倩，李 璐，周雅莉，安 茜，王計(jì)平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

為研究二酯酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2(PfDGAT2)在紫蘇種子油脂合成過程中的調(diào)控作用，對(duì)紫蘇DGAT2基因及其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，并研究了該基因在不同紫蘇品種中的表達(dá)特性。結(jié)果表明，PfDGAT2基因cDNA全長(zhǎng)1 249 bp，共編碼329個(gè)氨基酸；DGAT2蛋白的等電點(diǎn)為9.46，屬于堿性蛋白質(zhì)；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，紫蘇DGAT2蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)則卷曲(34.65%)和α-螺旋(30.09%)；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，紫蘇與芝麻和煙草的親緣關(guān)系較近，與油橄欖的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過研究PfDGAT2基因在含油量不同的2個(gè)紫蘇品種種子發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)特性，結(jié)果表明，該基因在開花后30 d形成的種子中表達(dá)量最高，但是二者又具有一定差異，晉紫蘇1號(hào)(含油量46.88%)表達(dá)量為開花后10 d的1.63倍，并紫蘇1號(hào)(含油量35.60%)為0.75倍，因此，推測(cè)DGAT2在紫蘇TAG生物合成中起重要調(diào)控作用。

紫蘇；二酯酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2(DGAT2)；生物信息學(xué)；表達(dá)特性分析

紫蘇(Perillafrutescens)又名桂荏、白蘇，系唇形科紫蘇屬一年生草本植物，是國(guó)家衛(wèi)生部首批頒發(fā)的既是食品又是藥品的中藥植物之一[1-3]。在紫蘇籽油中，α-亞麻酸含量高達(dá)62.73%，亞油酸為15.43%，油酸為12.01%，是目前所知α-亞麻酸含量最高的新型油料作物之一[4]。因此，紫蘇植物油被認(rèn)為是深海魚油的良好替代品[5-7]。

植物油作為食用油，不飽和脂肪酸含量較高，可以降低人體血液中膽固醇含量，降低動(dòng)脈硬化發(fā)生的概率[8]。植物油脂主要以三酰甘油(TAG)的形式貯藏在種子中，在TAG的合成積累過程中二酯酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因(DGAT2)起重要調(diào)控作用。目前，在植物中已發(fā)現(xiàn)有3種不同類型的DGAT基因，分別為DGAT1、DGAT2和DGAT3，廣泛存在于葉片、花瓣、果實(shí)、花粉囊以及發(fā)育的種子等不同器官中[9]，DGAT1在植物各器官中均有表達(dá)[10]，油桐DGAT2主要在種子發(fā)育時(shí)期高量表達(dá)[11]。DGAT2是生物體內(nèi)一種非常重要的酶，它被認(rèn)為是控制高甘油三酯(TAG)所致疾病，如肥胖癥、高血糖、糖尿病、脂肪肝等的潛在標(biāo)靶[12]。

本研究較為詳細(xì)地分析了紫蘇PfDGAT2基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)及該基因的表達(dá)特性，旨在為深入研究該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1植物材料

從晉蘇1號(hào)紫蘇根、莖、葉、花及種子混合樣品轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中挑選出功能注釋為DGAT2的基因，根據(jù)不同物種間同源基因的核酸序列相對(duì)保守的特點(diǎn)，將紫蘇中該基因序列與擬南芥DGAT2同源序列進(jìn)行比對(duì)分析，最后得到紫蘇DGAT2基因全長(zhǎng)cDNA序列。

選取含油量不同的2個(gè)紫蘇品種(中北大學(xué)張志軍老師提供)：晉紫蘇1號(hào)(含油量46.88%)和并紫蘇1號(hào)(含油量35.60%)，對(duì)發(fā)育不同時(shí)期的種子(開花后10，20，30，40 d)PfDGAT2基因表達(dá)特性進(jìn)行分析，研究該基因表達(dá)對(duì)紫蘇種子含油量的影響。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 紫蘇DGAT2基因序列及蛋白功能分析 通過在線分析軟件ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)對(duì)紫蘇DGAT2基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用TMHMM-2.0(http：// www.cbs.dtu.dk/ servi ces/ TMHMM-2.0/)軟件和SignalP 4.1(http：// www. cbs. dtu. dk/services/ SignalP/)對(duì)紫蘇DGAT2的跨膜域、信號(hào)肽進(jìn)行分析；采用在線軟件SOPMA對(duì)紫蘇DGAT2二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用在線分析軟件Swiss-Model(http：//www.swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行紫蘇DGAT2三級(jí)結(jié)構(gòu)分析及建模。運(yùn)用MEGA 6.0多序列比對(duì)軟件對(duì)紫蘇及其近緣種的DGAT2蛋白進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 根據(jù)紫蘇DGAT2基因的cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異引物，cDNA第1鏈合成采用TaKaRa公司試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量采用康潤(rùn)公司GenStar試劑盒。以紫蘇18SrRNA作為內(nèi)參基因[13]，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系(10 μL)：2×RealStar Green Power Mixture 5 μL，RNase-free H2O 4.2 μL，上下游引物各0.2 μL，ROX Reference Dye(50×)0.2 μL，模板cDNA 0.2 μL；采用2步法Real-time PCR，反應(yīng)過程為：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，57 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1PfDGAT2基因全長(zhǎng)cDNA序列及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

紫蘇DGAT2基因全長(zhǎng)cDNA序列1 249 bp，開放閱讀框(ORF)為990 bp,起始密碼子ATG位于167 bp處，終止密碼子TAA位于1 156 bp處，共編碼329個(gè)氨基酸殘基(圖1)，其中，亮氨酸含量最多(10%)，谷氨酰胺含量最少(0.9%)；原子總數(shù)5 293，相對(duì)分子量為37.017 7 kDa；預(yù)測(cè)紫蘇DGAT2蛋白等電點(diǎn)為9.46，不穩(wěn)定系數(shù)為41.59，脂溶系數(shù)為100.09，總平均親水系數(shù)為0.272，因此，推測(cè)其為親水性脂溶蛋白。

圖1 PfDGAT2基因的全長(zhǎng)序列以及編碼的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA of PfDGAT2 gene and amino acid sequences translated

紫蘇DGAT2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)顯示(圖2)，DGAT2蛋白在29-51位、53-75位氨基酸之間形成了2個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，表明PfDGAT2蛋白可能是一個(gè)與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。

使用SignalP 4.1對(duì)紫蘇DGAT2蛋白進(jìn)行信號(hào)肽及切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)(圖3)，結(jié)果顯示，該蛋白沒有信號(hào)肽。

圖2 PfDGAT2蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 The prediction of transmembrane domain for DGAT2 protein in Perilla frutescens

圖3 PfDGAT2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Predicted signal peptide of DGAT2 protein in Perilla frutescens

運(yùn)用SOPMA對(duì)紫蘇DGAT2蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由4種結(jié)構(gòu)元件組成：無規(guī)則卷曲(34.65%)、α-螺旋(30.09%)、延伸鏈(23.71%)、β-轉(zhuǎn)角(11.55%)。利用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示。

使用MEGA 6.0多序列比對(duì)軟件對(duì)紫蘇(Perillafrutescens)及其芝麻(Sesamumindicum)、油橄欖(Oleaeuropaea)、向日葵(Helianthusannuus)、煙草(Nicotianatabacum)等DGAT2基因編碼蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹，分析結(jié)果顯示，紫蘇與芝麻、煙草親緣關(guān)系較近，與油橄欖親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。

圖4 PfDGAT2蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 4 The tertiary structure prediction of DGAT2 protein in Perilla frutescens

圖5 PfDGAT2與不同物種DGAT2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of PfDGAT2 and DGAT2 protein in different species

2.2PfDGAT2基因表達(dá)特性分析

為了進(jìn)一步了解DGAT2基因在紫蘇種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性與種子含油量的關(guān)系，本研究選取含油量不同的2個(gè)紫蘇品種晉紫蘇1號(hào)(含油量46.88%)和并紫蘇1號(hào)(含油量35.60%)，對(duì)DGAT2基因在種子發(fā)育不同時(shí)期進(jìn)行表達(dá)特性分析(圖6)。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，該基因在2個(gè)品種開花后10 d的表達(dá)量都比較高，然后降低，到開花后30 d表達(dá)量又達(dá)到高峰，分別以并紫蘇1號(hào)、晉紫蘇1號(hào)開花后10 d作為對(duì)照，并紫蘇1號(hào)開花后30 d表達(dá)量為開花后10 d的0.75倍，而晉紫蘇1號(hào)為1.63倍。

a、b表示在0.05水平方差分析差異顯著性。 a and b indicates significant difference at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

在植物中，三酰甘油(TAG)是油料作物種子中能量貯存的主要形式，其主要機(jī)制是使二酰甘油加上脂肪酸酰基輔酶A以共價(jià)鍵結(jié)合形成三酰甘油。DGAT2被認(rèn)為是多種植物中調(diào)控種子油含量的關(guān)鍵酶，對(duì)于調(diào)節(jié)種子脂肪酸組成具有重要作用[14]。為進(jìn)一步了解DGAT2基因在紫蘇油脂合成過程中的功能，本研究對(duì)該基因進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，該基因cDNA全長(zhǎng)序列為1 249 bp，共編碼329個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量為37.017 7 kDa，屬于親水性脂溶蛋白；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)DGAT2為膜受體蛋白；無規(guī)則卷曲和α-螺旋是二級(jí)結(jié)構(gòu)中最主要的結(jié)構(gòu)元件；對(duì)DGAT2蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，紫蘇與芝麻、煙草親緣關(guān)系較近，與油橄欖親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

TAG是大多數(shù)植物和動(dòng)物體內(nèi)最重要的油脂貯藏形式，DGAT是TAG合成反應(yīng)的限速酶之一，對(duì)于種子油脂合成起重要調(diào)控作用[9]。DGAT2存在于動(dòng)物、植物和酵母中，經(jīng)試驗(yàn)證明，DGAT2在大豆等轉(zhuǎn)基因油料作物中過量表達(dá)均能提高種子的含油量[15]。Shockey等[11]研究證明，DGAT2對(duì)種子三酰甘油的合成起著關(guān)鍵作用，雖然DGAT2與DGAT1都能催化二酰甘油結(jié)合CoA形成三酰甘油，在大多數(shù)高等植物的各組織器官中DGAT1基因均有表達(dá)，但DGAT2更側(cè)重于特殊脂肪酸的積累，在一些含有稀有脂肪酸的植物中，DGAT2可能對(duì)于種子油脂積累具有更重要的作用[16-18]。Lardizabal等[14]將拉曼毛霉(Umbelopsisramanniana)DGAT2A(UrDGAT2A)在大豆中高量表達(dá)，結(jié)果使得種子含油量提高了1.5%。紫蘇籽的油脂含油率達(dá)40%～50%[19-20]，并且主要以TAG形式存在，為了研究DGAT2基因在紫蘇種子油脂積累過程中的作用，本研究對(duì)含油量不同的2個(gè)紫蘇品種不同發(fā)育時(shí)期的種子進(jìn)行表達(dá)特性分析，結(jié)果表明，DGAT2基因在晉紫蘇1號(hào)、并紫蘇1號(hào)2個(gè)品種種子發(fā)育不同時(shí)期中均有表達(dá)，在開花后30 d表達(dá)量達(dá)到最高，并且晉紫蘇1號(hào)開花后30 d表達(dá)量為開花后10 d的1.63倍，高于并紫蘇1號(hào)，表明DGAT2基因在紫蘇種子TAG生物合成過程中起重要作用。

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BioinformaticsandExpressionAnalysisofPfDGAT2GeneinPerillafrutescens

LIANG Qian，LI Lu，ZHOU Yali，AN Xi，WANG Jiping

(College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China)

In order to study the regulatory role of Diacylgycerol Acyltransferase 2 (PfDGAT2) in the process of oil and lipid synthesis ofPerillafrutescensseeds, the structure and functions of the protein were analyzed by bioinformatics methods, and the gene expression characteristics were studied in differentPerillafrutescensvarieties. The results showed thatPfDGAT2 gene full-length cDNA was 1 249 bp，encoding 329 amino acid.PfDGAT2 protein isoelectric point was 9.46，belonging to the basic protein. The secondary structure prediction showed that the main components of PfDGAT2 protein were random coil (34.65%) and alpha helix (30.09%). Phylogenetic tree analysis indicated thatPerillafrutescenshad closer genetic relationship withSesamumindicumandNicotianatabacum，and had farther relationship withOleaeuropaea. By studying the expression characteristics ofPfDGAT2 gene in two differentPerillafrutescensvarieties, the relationship betweenPfDGAT2 gene expression and oil content was analyzed. The results showed that the expression level of the gene was the highest at 30 days after flowering, but there was a certain difference between two varieties. The expression level of Jinzisu 1 (oil content 46.88%) was 1.63 times of that of 10 days after flowering, but Bingzisu 1 (oil content 35.60%) was 0.75 times.It suggested thatDGAT2 gene played a major regulatory role in TAG biosynthesis ofPerillafrutescens.

Perillafrutescens；Diacylgycerol acyltransferase 2(DGAT2)；Bioinformatics；Expression analysis

2017-08-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201266)；山西省晉中市科技重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(農(nóng)業(yè))項(xiàng)目(Y172007-5)

梁 倩(1990-)，女，山西臨汾人，在讀碩士，主要從事紫蘇脂肪酸代謝機(jī)理研究。

王計(jì)平(1974-)，女，山西陽泉人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物油脂代謝機(jī)理研究。

S565.03；Q78

A

1000-7091(2017)05-0086-05

10.7668/hbnxb.2017.05.013