補腎養血明目方對ARPE-19細胞氧化損傷的保護機制研究

陳強，安娜，梁麗娜，莊曾淵

補腎養血明目方對ARPE-19細胞氧化損傷的保護機制研究

陳強，安娜，梁麗娜，莊曾淵

目的 探討補腎養血明目方對氫醌（hydroquinone,HQ）誘導的人視網膜色素上皮細胞（ARPE-19）氧化損傷的保護機制。方法 采用HQ制作ARPE-19細胞氧化應激損傷模型，分為正常對照組，模型組，空白腸吸收液組，預防給藥組和治療給藥組。分別采用TUNEL技術觀察細胞凋亡情況，免疫組化技術檢測8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的表達情況，化學發光法測定細胞內ATP含量，熒光法測定活性氧（ROS）水平，化學比色法檢測細胞中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量。結果 與氧化損傷模型組相比，補腎養血明目方可減少ARPE-19細胞凋亡，抑制細胞內ATP的水平下降，減少ROS的生成，減少RPE細胞8-OHdG陽性表達率，提高抗氧化酶（SOD和GSH-Px）的含量。結論 線粒體保護是補腎養血明目方發揮抗HQ誘導的ARPE-19細胞氧化損傷的重要途徑。

補腎養血明目方；ARPE-19；氧化損傷

目前多項研究已證實視網膜色素上皮視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）細胞的損傷或增殖在年齡相關性黃斑變性 （age-related macular degeneration,AMD）、視網膜色素變性（retinitis pigmentosa,RP）、增生性玻璃體視網膜病變（prolifera-tive vitreoretinopathy,PVR）等多種視網膜疾病的發生發展中起著重要的作用[1-3]。因此，保護RPE細胞正常生理性結構、功能和數量、抑制RPE細胞的損傷變性，已成為治療AMD、RP等疾病的新方向。補腎養血明目方是我院臨床上治療AMD和RP的臨床經驗方，前期體內實驗及體外實驗均顯示對RPE細胞有較好的保護作用，并提示作用機制與線粒體保護有關[4-5]。在前期基礎上，我們以氫醌（hydroquinone,HQ）誘導建立人視網膜色素上皮細胞系ARPE-19氧化損傷模型，觀察該組方對RPE細胞的保護作用，進一步完善對藥物作用機制的認識，具體報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要儀器

ARPE-19細胞購自于廣州吉妮歐生物科技有限公司。氫醌、DCFH-DA熒光探針（Sigma-Aldrich）；DMEM高糖培養基（HyClone）；0.25%胰蛋白酶EDTA 消化液（Solarbio）；胎牛血清（Gibco）；TUNEL 試劑盒（Roche）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）檢測試劑盒（南京建成）；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）檢測試劑盒（南京建成）；CellTiter-GloRLuminescent Cell Viability Assay試劑盒（Promega）。 CO2培養箱（德國 heraeus公司）；組織-器官水浴系統（上海奧爾科特生物科技有限公司）；紫外-可見分光光度計（英國熱電）；熒光分光光度計（美國柏金埃爾默公司）；熒光顯微鏡（Olympus）；多功能酶標儀（美國博騰儀器有限公司，BioTek Synergy H1）。

1.2 方法

1.2.1 RPE細胞培養 將RPE細胞接種于含體積分數15%胎牛血清的DMEM/F12培養液中，置于37℃、體積分數為5%CO2培養箱中常規培養，細胞貼壁后，每2 d更換一次培養液，接近融合狀態時消化傳代，第4～6代細胞用于實驗。

1.2.2 補腎養血明目方含藥腸吸收液的制備 補腎養血明目方方藥組成包括當歸、遠志、黃芪等，其濃縮干浸膏由中國中醫科學院中藥研究所提供 （2.3 g生藥/g)，稱取適量浸膏加純凈水配成含藥水溶液（0.144 g生藥/ml）。SD大鼠隨機分為含藥腸吸收液組和空白腸吸收液組，通過ALC-M型組織-器官水浴系統采用外翻腸囊法制備腸吸收液[6]，向每個浴管中預先加入25 ml補腎養血明目方供試液 （腸吸收液組）或不含藥物的臺氏緩沖液（空白腸吸收液組），通入 95%O2和 5%CO2的混合氣體，37℃恒溫。0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，分裝至無菌EP管中，-20℃保存備用。

1.2.3 實驗分組 細胞分為5組：（1）正常對照組（正常組）：以正常培養液培養；（2）氧化損傷模型組（模型組）：90 μmol/L 氫醌作用 24 h；（3）空白腸吸收液組：空白腸吸收液作用24 h后，加入90 μmol/L氫醌作用24 h；（4）預防給藥組（預防組）：補腎養血明目方腸吸收液作用24 h后，加入90 μmol/L氫醌作用 24h；（5）治療給藥組（治療組）：90μmol/L 氫醌作用24 h后，加入補腎養血明目方腸吸收液作用24 h。

1.2.4 TUNEL染色鑒定凋亡細胞 對數生長期ARPE-19細胞以1×106/ml的濃度接種于35 mm培養皿內，細胞分組同上，根據細胞活力預防組及治療組均采用2%的補腎養血明目方腸吸收液。各組經相應處理后吸出細胞培養液，嚴格按照TUNEL檢測試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡觀察，計數RPE凋亡細胞及RPE細胞總數，計算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細胞數/同視野RPE細胞總數×100%。

1.2.5 RPE細胞DNA損傷測定 以免疫組織化學的方法檢測DNA氧化損傷產物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG）。 實驗分組及相應處理同1.2.3項，吸出細胞培養液，按如下操作進行：4%多聚甲醛固定；PBS漂洗；0.25%TritonX-100溶液作用30 min；10%山羊血清封閉；加入一抗 mouse anti 8-OHdG（1:500）孵育 2 h；PBS 漂洗；加入二抗goat anti mouse AF555 （1:400）孵育2 h。PBST浸洗；加500 μl DAPI溶液在標本上，室溫下孵育5 min；PBS浸洗5 min；稍干后用抗熒光衰減封片劑封片；熒光倒置顯微鏡觀察。每張片子隨機選取5個視野，計數RPE細胞DNA損傷標記數及RPE細胞總數，計算DNA損傷率。損傷率（%）=8-OHdG陽性染色細胞數/同視野RPE細胞總數×100%。

1.2.6 RPE細胞內腺苷三磷酸 （adenosine triphosphate,ATP）的測定 細胞接種于白璧透明底96孔細胞培養板，實驗分組及處理同1.2.3項。采用CellTiter-GloRLuminescent Cell Viability Assay試劑盒檢測各組RPE細胞內ATP含量。培養板每孔加入 CellTiter-GloRReagent 100 μl，震板 2 min，室溫孵育10 min，穩定化學發光信號，酶標儀讀數。

1.2.7 RPE細胞內活性氧 （reactive oxygen species,ROS）的測定 DCFH-DA本身沒有熒光，進入細胞內后，被水解生成DCFH，DCFH不能通透細胞膜，并且可被細胞內的活性氧化成發出綠色熒光的DCF。因此，檢測綠色熒光的強弱可以間接反映細胞內ROS的水平。RPE細胞接種于96孔培養板，48 h后，以含10 μmol/L DCFH-DA的無血清培養液，37℃孵育30 min，預先原位裝載DCFH探針，實驗分組及相應處理同1.2.3項。采用酶標儀于488 nm激發波長，525 nm發射波長，檢測各孔熒光值。

1.2.8 RPE細胞內SOD、GSH-Px含量的測定 按照試劑盒說明書，采用比色法測定細胞內SOD、GSH-Px的含量。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差表示，多組均數間比較采用完全隨機設計的方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補腎養血明目方對RPE細胞凋亡的影響

正常組、模型組、空白腸吸收液組、預防組和治療組的凋亡率分別為 （0.221±0.47）%、（13.333±5.16）%、（15.452±7.03）%、（7.927±2.09）%和（8.974±3.45）%（F=17.130，P<0.001）。 模型組及空白腸吸收組凋亡率較正常組明顯升高（P＜0.05），預防組和治療組的凋亡率高于正常組（P＜0.05）并低于模型組及空白腸吸收組（P＜0.05）。模型組與空白腸吸收液組間以及預防組和治療組間的差異均無統計學意義（P＞0.05）（圖 1）。

2.2 補腎養血明目方對線粒體DNA損傷的影響

圖1 各組ARPE-19細胞凋亡率的比較。F=17.130，P<0.001。與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與空白腸吸收液組比較，cP＜0.05（單因素方差分析，LSD-t檢驗）

陽性細胞成紫紅色著染，形態呈C型，均勻固縮狀。由圖2可見，正常組RPE細胞DNA損傷較輕，陽性細胞數少，表達較弱，模型組和空白腸吸收液組細胞有較多損傷，陽性表達較強，治療組和預防組RPE細胞DNA損傷較模型組減少，其中預防組細胞損傷最輕（圖2）。

圖2 熒光顯微鏡下各組ARPE-19細胞8-OHdG 的表達 （200×）2A.正常組；2B.模型組；2C.空白腸吸收液組；2D.預防組；2E.治療組。藍色為DAPI著染的細胞核，紫紅色為8-OhdG陽性細胞 8-OHdG：8-羥基脫氧鳥苷

正常組、模型組、空白腸吸收液組、預防組和治療組的 DNA損傷率分別為 （1.444±2.09）%、（16.631±3.79）%、（13.631±5.22）%、（7.913±2.07）%和 （9.776±3.96）%（F=24.368，P＜0.001）。 正常組的DNA損傷率最低 （P＜0.05），其次是預防組和治療組，模型組和空白腸吸收液組的DNA損傷率最高，明顯高于預防組和治療組（P＜0.05）。模型組與空白腸吸收液組間以及預防組和治療組間的差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 補腎養血明目方對ARPE-19細胞內ATP水平的影響

正常組的ATP含量最高，模型組數值最低（P＜0.05）。空白腸吸收液組明顯高于模型組（P＜0.05），但低于正常組（P＜0.05）；預防組的ATP含量較空白腸吸收液組增加（P＜0.05），與正常組較為接近（P＞0.05）；治療組ATP含量高于空白腸吸收液組 （P＞0.05）并略低于干預組（P＞0.05）（圖 3）。

2.4 補腎養血明目方對ARPE-19細胞內ROS產生的影響

圖3 各組ARPE-19細胞內ATP含量的比較（多功能酶標儀化學發光檢測）。F=39.022，P<0.001。與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與空白腸吸收液組比較，cP＜0.05（單因素方差分析，LSD-t檢驗）ATP：腺苷三磷酸

模型組和空白腸吸收液組細胞內的ROS均較正常組顯著增加（P＜0.05），預防組和治療組RPE細胞內ROS含量低于模型組（P＜0.05）和空白腸吸收液組，與正常組接近（P＞0.05），預防組的ROS含量相對更低一些，與空白腸吸收液組空白組的數值差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組與空白腸吸收液組間以及預防組和治療組間的差異均無統計學意義（P＞0.05）（圖 4）。

圖4 各組ARPE-19細胞內ROS含量的比較（多功能酶標儀熒光檢測）。 F=4.264，P<0.05。 與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與空白腸吸收液組比較，cP＜0.05（單因素方差分析，LSD-t檢驗）ROS：活性氧

2.5 補腎養血明目方對RPE細胞內SOD、GSH-Px含量變化的影響

SOD含量：模型組和空白腸吸收液組RPE細胞中的SOD含量較正常組明顯下降（P＜0.05），預防組和治療組細胞內的SOD較模型組（P＜0.05）和空白腸吸收液組增加，預防組的數值變化更為明顯，高于空白腸吸收液組（P＜0.05），接近正常組（P＞0.05）。 模型組與空白腸吸收液組間以及預防組和治療組間的差異均無統計學意義（P＞0.05）（圖 5A）。

GSH-Px含量：各組細胞內GSH-Px情況與SOD類似，模型組和空白腸吸收液組的GSH-Px含量較正常組下降（P＜0.05），預防組和治療組的GSH-Px則較模型組和空白腸吸收液組增加，并與正常組數值接近（P＞0.05）（圖 5B）。

圖5 ARPE-19細胞內SOD和GSH-Px含量的比較 （多功能酶標儀比色法）。 5A.SOD（F=9.072，P＜0.05）;5B.GSH-Px（F=5.420，P＜0.05）。與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與空白腸吸收液組比較，cP＜0.05（單因素方差分析，LSD-t檢驗）SOD：超氧化物歧化酶GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶

3 討論

氧化應激損傷是指機體在遭受各種有害刺激如環境因素、營養障礙和遺傳因素時，體內活性氧（ROS）和活性氮（reactive nitrogen species,RNS）等高活性分子產生過多，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織細胞損傷[7]。多個流行病學調查、動物及細胞實驗都證明氧化應激在AMD發病過程中起重要作用，RPE細胞的氧化應激損傷是關鍵的發病機制，而吸煙是誘發AMD主要的氧化應激因素[8-10]。香煙中的焦油含有高濃度的氧化劑前體，其中氫醌的含量最高，我們前期實驗采用氫醌成功誘導出小鼠早期AMD模型[11]，此次實驗我們采用90μmol/L氫醌建立體外ARPE-19細胞氧化損傷模型。

補腎養血明目方是名老中醫莊曾淵多年的臨床經驗方，方藥組成包括枸杞子、淫羊藿、當歸、石斛等，其中枸杞子、淫羊藿補益腎精，當歸、石斛養血明目，諸藥合用，共奏補腎養血明目功效。我們前期動物實驗發現補腎養血明目方對碘酸鈉誘導的視網膜變性損傷有保護作用，可以減輕視網膜病變程度，減少RPE細胞的凋亡[5]；體外細胞培養實驗亦發現補腎養血明目方含藥血清可以保護丙烯醛誘導的ARPE-19細胞氧化應激損傷[4]。本次試驗結果顯示補腎養血明目方含藥腸吸收液組細胞凋亡率小于模型組及空白腸吸收液 （P＜0.05），預防給藥組效果更為明顯（P＜0.01），提示補腎養血明目方對氫醌誘導的氧化應激損傷有保護作用，這與我們以前的研究結果相一致。

線粒體是真核動物細胞進行生物氧化和能量轉換的主要場所，細胞生命活動所需能量的80%是由線粒體提供的，線粒體生物氧化和能量轉化的過程中會產生很多ROS，是細胞內ROS的主要來源。線粒體的結構暴露于高濃度的ROS下，當氧化應激發生的時候，線粒體成為ROS攻擊的首要靶細胞器。過量的活性氧攻擊線粒體DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）及線粒體內蛋白質、脂類等生物大分子物質，使其能量合成受到障礙，最終導致線粒體功能下降[12]。雖然目前對線粒體氧化應激損傷后導致細胞功能下降、死亡的具體機制尚不完全清楚，但研究顯示mtDNA損傷可以引發細胞凋亡或者壞死。mtDNA位于線粒體腔內接近內膜的位置，對氧化應激比細胞核DNA（nuclear DNA,nDNA）更為敏感。mtDNA的功能障礙，直接影響線粒體的氧化磷酸化功能，使呼吸鏈中斷，ATP產生減少，ROS生成增多，形成惡性循環，最終導致整個細胞功能瓦解。mtDNA的損傷程度可以反映細胞整體的氧化損傷情況[13]。He Y等發現當線粒體功能下降時，RPE對氧化應激的敏感性明顯增加[14]。Feher J和Karunadharma通過尸檢發現在AMD患者的視網膜中明確存在mtDNA的異常，異常程度與AMD病理改變呈高度相關性，提示mtDNA損傷在AMD的發生和發展中起著重要作用[15-16]。8-OHdG被認為是mtDNA在體內氧化損傷的標志物[17]，我們以此來評價mtDNA的氧化損傷程度。本次實驗發現補腎養血明目方可以增加細胞內ATP的水平，減少ROS的生成，減輕mtDNA損傷，提高抗氧化酶（SOD和GSH-Px）的含量。因此，我們推測補腎養血明目對線粒體介導的凋亡途徑有阻斷作用。

綜上所述，我們認為補腎養血明目方對RPE細胞的氧化應激損傷有保護作用，其作用機制可能是通過保護mtDNA，進而減少由于mtDNA損傷引發的級聯反應。將來的研究重點一方面繼續深入探討作用機制，同時在基礎研究的支持下，擬開展多中心、隨機、盲法、對照的臨床試驗以充分證明補腎養血明目方的安全性和有效性，從而在臨床推廣應用。

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Study on protective mechanisms of Bushen Yangxue Mingmu Formula on oxidative injury of ARPE-19 cells

CHEN Qiang,AN Na,LIANG Lina,et al.Eye Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100040,China

OBJECTIVE To investigate the possible protective mechanism of Bushen Yangxue Mingmu(BSYXMM)Formula on ARPE-19 cells under oxidative stress induced by Hydroquinone(HQ).METHODS The oxidative stress models of ARPE-19 cells were induced by HQ and divided into normal control group,model group,blank group,preventive group and treatment group.The percentage of apoptotic cells was measured by TUNEL assay and the expression of 8-OHdG was detected by immunohistochemical analysis.Chemiluminescence detection was used to determine ATP(adenosinetriphosphate)and ROS(reactive oxygen species)content.The contents of superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)were detected by colorimetry.RESULTS Compared to the model group,BSYXMM Formula significantly reduced apotosis in ARPE-19 cells,inhibited the decline of ATP levels,decreased the production of ROS and alleviated mtDNA damage.Moreover,BSYXMM Formula increased the content of SOD and GSH-Px.CONCLUSIONS Mitochondrial protection was the important pathway for BSYXMM formula protecting against HQ-induced oxidative stress injury in ARPE-19 cells.

Bushen Yangxue Mingmu Formula;ARPE-19 cell;oxidative injury

R285.5

A

1002-4379（2017）04-0218-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.04.002

國家自然科學基金青年基金項目（81503621）；國家自然科學基金項目（81674033）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（ZZ0908027）

中國中醫科學院眼科醫院，北京100040

梁麗娜，E-mail：lianglina163@163.com