正交試驗(yàn)提取齒瓣石斛多糖工藝優(yōu)化研究

王洪云+王文靜+馬光宇+張尹+李銘

摘要：目的 優(yōu)化齒瓣石斛多糖提取工藝。方法 采用正交設(shè)計(jì)，考察提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和料液比等4個影響因素。結(jié)果 最佳提取工藝條件為：溫度100 ℃、料液比 1：25、提取時間 1 h、提取次數(shù) 2次。結(jié)論 該提取工藝穩(wěn)定可行，多糖提取率高。

關(guān)鍵詞：齒瓣石斛；多糖；正交設(shè)計(jì)；提取工藝

中圖分類號：R2842 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）10-0075-02

石斛是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）植物新鮮或干燥莖的統(tǒng)稱，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳等功效[1]。石斛屬植物中藥用的有金釵石斛、鐵皮石斛、馬鞭石斛、黃草石斛、環(huán)草石斛等5種，但由于石斛資源緊缺，混作藥用石斛約有50余種，其中，以齒瓣石斛規(guī)模較大[2-4]。

齒瓣石斛Dendrobium devonianum Paxt，又名紫皮石斛、香棍草、大黃草，為西南各省區(qū)石斛藥材主要習(xí)用品種之一，也是云南重點(diǎn)開發(fā)的藥物資源。石斛多糖是齒瓣石斛等多種石斛中的主要有效成分之一，含量在3%-46%之間[5-7]，其生物活性十分顯著，在食品藥品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。但是各種多糖含量和提取率差異較大，本研究通過正交試驗(yàn)對齒瓣石斛多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為今后的深入開發(fā)利用提供一些參考。

1 材料與方法

11 儀器 Shimadzu UV-2450紫外光譜儀（日本島津公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琪公司）、PL-203電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

12 試劑 葡萄糖（中國藥品生物制品檢驗(yàn)所）、苯酚（天津市化學(xué)試劑三廠）、硫酸、乙醇等均為分析純（成都科龍化工）。

13 藥材 齒瓣石斛，購于云南省龍陵縣，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院錢子剛教授鑒定為齒瓣石斛（Dendrobium devonianum Paxt）。鮮品，洗凈，60℃烘干，粉碎過60目篩，置干燥器中，備用。

14 試驗(yàn)方法 按《中華人民共和國藥典》（2015版）一部[8]鐵皮石斛多糖含量測定方法測定齒瓣石斛多糖含量。

141 溶液的制備

1411 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1235 mg，置100 mL容量瓶中加適量蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（每1 mL含葡萄糖01235 mg）。

1412 供試品溶液的制備。取樣品粉末約03 g，精密稱定，加水200 mL，加熱回流2 h，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液4 mL，置15 mL離心管中，精密加入無水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）20 min，棄去上清液（必要時濾過），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。測定方法：精密量取供試品溶液10 mL，置于10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自精密加入5%苯酚溶液1 mL起，依法測定吸光度，按線性回歸方程計(jì)算多糖含量。

142 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液01、02、04、06、08、10 mL，分別置于10 mL具塞試管中，各加水補(bǔ)至10 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL（臨用配置），搖勻，再精密加入硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以蒸餾水為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在488 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=00701x+00073，r=09998（n=6）。結(jié)果表明：葡萄糖在1764～17643 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

143 正交設(shè)計(jì) 主要考察提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和料液比等四個影響因素，見表 1。以此進(jìn)行 L9（3）4 4因素3水平正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

21 正交試驗(yàn)結(jié)果 對提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和料液比等四個影響因素進(jìn)行 L9（3）4 正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由正交試驗(yàn)極差分析可知，因素主次順序?yàn)?A>D>B>C，即最重要的因素為提取溫度，其次是料液比，再次是提取時間，最后是提取次數(shù)。最佳組合為 A3B1C2D3，即提取工藝參數(shù)為溫度100 ℃、料液比 1：25、提取時間 1 h、提取次數(shù) 2次。

22 重現(xiàn)性試驗(yàn) 照優(yōu)選出的最佳提取工藝制備5份樣品液，測定吸光度值，計(jì)算多糖提取率，RSD=325%，結(jié)果表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

23 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一樣品液，平行取樣5次，測定吸光度值，計(jì)算RSD=317%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

24 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按照正交結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，齒瓣石斛多糖得率為 379%，RSD=261%（n=3）。結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究建立了齒瓣石斛多糖提取工藝，采用正交設(shè)計(jì)對提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和料液比等四個影響因素進(jìn)行考察，結(jié)果表明提取溫度對提取率影響最大，其次是提取料液比，再次是提取時間，影響最小的是提取次數(shù)，最佳提取工藝為溫度100 ℃、料液比 1：25、提取時間 1 h、提取次數(shù) 2次，該工藝穩(wěn)定性好，可行。

參考文獻(xiàn)：

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院中藥大辭典[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1985：586

[2]明興加，張明，陶文靜，等名貴中藥齒瓣石斛的開發(fā)前景[J].重慶中草藥研究，2006，54（2）：51

[3]李安華，沈妍，趙興燦，等云南產(chǎn)17種楓斗類石斛資源和原植物初步的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22（3）：723

[4]王洪云，李銘，郝俊杰，等齒瓣石斛研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（11）：2732-2735

[5]李亞芳，張曉華，孫國明石斛中總生物堿和多糖的含量測定[J].中國藥事，2002，16（7）：426-428

[6]吳迪，王巖，巴哈爾古麗·卡哈爾，等齒瓣石斛多糖提取及脫蛋白工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（11）：2841-2843

[7]葉子，蘆葉，薛亞甫，等鐵皮石斛專屬性成分的分離制備及專屬性研究[J].中國中藥雜志，2016，41（13）：2481-2486

[8]中國藥典一部[S].2015：282-283endprint