當歸揮發油上調自發性高血壓大鼠TLR3，TRIB1基因的表達

曲 強 紀祿風 石向慧 王利紅 伊 琳

(甘肅中醫藥大學中西醫結合學院，甘肅 蘭州 730000)

1 甘肅省人民醫院

·基礎研究·

當歸揮發油上調自發性高血壓大鼠TLR3，TRIB1基因的表達

曲 強1紀祿風 石向慧 王利紅 伊 琳

(甘肅中醫藥大學中西醫結合學院，甘肅 蘭州 730000)

目的通過研究當歸揮發油對自發性高血壓大鼠(SHR)肝臟組織中TRIB1、TLR3 mRNA水平表達的影響，探討當歸揮發油對SHR脂代謝的改善作用及其機制。方法將8周齡雄性SHR隨機分為模型組，當歸揮發油組低劑量組(含5%的揮發油)，當歸揮發油組高劑量組(含10%的揮發油)和阿托伐他汀鈣組，并用同周齡的Wistar 大鼠作為正常對照組。各組大鼠分別灌胃4 w后，測定給藥前后血壓的變化。取大鼠肝臟組織，HE染色觀察各組大鼠肝臟組織的結構變化，QT-PCR檢測TRIB1、TLR3 mRNA水平的表達。結果當歸揮發油能降低SHR的血壓。TRIB1，TLR3在各用藥組表達上調，且呈差異性表達，在揮發油組不同劑量組之間亦呈差異性上調表達。結論當歸揮發油對SHR脂代謝有調節作用，通過上調TRIB1、TLR3 mRNA水平抑制動脈粥樣硬化而降壓，從而影響脂代謝。

當歸揮發油；脂代謝；TRIB1；Toll樣受體3

高血壓和脂代謝異常都是動脈硬化的危險因素，當二者合并時，動脈硬化的危險性增加〔1〕。當歸為甘肅省道地藥材，其味辛、甘，性微溫，歸心、肝、脾三經，尤以岷縣當歸為佳。據古籍記載，當歸具有調經止痛、補血活血、潤腸通便的功效。現代醫學證明當歸有明顯的降壓作用，對血脂和免疫都具有雙向調節作用，且對致粥樣硬化指數和血液流變學指標均有一定的影響。當歸作為抗高血壓和調節脂代謝藥物，對減輕動脈粥樣硬化、提高生活質量有積極的臨床意義〔2〕。

1 材料與方法

1.1動物選擇與分組 32只8周齡雄性自發性高血壓大鼠(SHR)(體重180～220 g)，SPF級，購自北京維通利華實驗動物有限責任公司，動物合格證號SCXK(京)2012-0001，動物檢疫合格證No.1100562901。8只正常血壓 Wistar 大鼠(體重180～220 g)，雄性，SPF級，購自甘肅中醫學院實驗動物中心〔動物合格證號SYXK(甘) 2011-0001〕。隨機分為模型組與當歸治療組(低、高)，阿托伐他汀鈣組，Wistar 大鼠為正常對照組，每組8只。試驗程序和方法得到甘肅中醫學院醫學倫理學會批準。

1.2藥物與試劑選擇 當歸購于甘肅省岷縣，由甘肅中醫學院科研實驗中心提取揮發油，采用CO2超臨界萃取法，阿托伐他汀鈣片(國藥準字H19990258)，TRIB1，TLR3引物(生工生物工程上海有限公司)，QT-PCR儀(7900，Applied Biosystems company)，酶標儀(Thermo company),TRIzol，氯仿，異丙醇，逆轉錄試劑盒(TaKaRa)，QT-PCR試劑盒(TaKaRa)，Power Lab ML125/R無創尾動脈血壓器(日本)，低溫搖床，低溫離心機(Dynamica company)，紫外分光光度計(Quawell company)。

1.3方法

1.3.1給藥方法和分組 將SHR和Wistar大鼠在SPF級實驗室適應性飼養1 w后，于給藥前測定各組大鼠的血壓，采用Power Lab ML125/R無創血壓測定分析系統測定清醒狀態下鼠尾動脈收縮壓，連續測定1 w，待各組大鼠適應環境后，模型組和正常對照組灌胃生理鹽水，不給任何藥物。當歸治療組、阿托伐他汀鈣組根據實驗鼠體表面積最終確定給藥劑量，當歸低、高劑量組分別灌胃37 mg·kg-1·d-1(含5%的揮發油)，100 mg·kg-1·d-1(含10%的揮發油)，阿托伐他汀鈣組為60 mg·kg-1·d-1。每周給藥7 d，每天定時給藥，連續4 w，并隨體重變化每周按時調整給藥劑量。每周的第7天測定血壓，每周于同一時間測定，每只每次測定5次，取平均值。試驗期間，各組大鼠標準飲食，自由飲水。

1.3.2肝臟標本的制備 給藥4 w后，將動物禁食不禁水12 h，按照體重的不同，分別進行3%水合氯醛(避光)腹腔注射，麻醉后將大鼠頸椎脫臼處死，開腹取出肝臟組織100 mg，將肝臟分為上中下三部分，中部標本經10%甲醛溶液固定，石蠟組織包埋對肝臟組織進行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察肝臟組織病理學切片變化。

1.3.3肝臟總RNA的提取與檢測 各組大鼠處死后，焦碳酸二乙酯(DEPC)水沖洗后，取肝臟組織50 mg，按TRIzol一步法提取總RNA，紫外分光光度計測其純度與濃度，各組大鼠260/280的比值在1.8～2.0，說明其純度相對較好。1%瓊脂糖變性凝膠電泳測其完整性。總RNA提取后，按照TaKaRa公司逆轉錄說明書PrimeSciptTMRT Waster MIX 操作進行逆轉錄，各引物序列如下：TRIB1前向：5′CCTTGGGGTGATGCTCTACA3′,反向：5′TGGCTTTGGGGGAAACAT3′；TLR3前向：5′TTAGCAACCAGCAACAGCAC3′，反向：5′GCCAAGAGAAGGCATCGTTA3′；GAPDH前向：5′AGGCCGGTGCTGAGTATGTC3′，反向：5′TGCCTGCTTCACCACCTTCT3′。逆轉錄條件：37℃ 15 min(反轉錄反應) 85℃ 5 s(反轉錄酶的失活反應)4℃ 30 min，-20℃保存。逆轉錄結束后，應用SYBR?Premix Ex TaqTMII說明書進行QT-PCR檢測，QT-PCR檢測反應體系25 μl，反應條件：預孵育95℃ 30 s；擴增95℃ 5 s，60℃ 30 s，75℃ 30 s，45個循環；最后延伸階段結束。

1.4統計學方法 應用SPSS20.0軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA方差分析，并行兩兩比較。

2 結 果

2.1各組用藥前后血壓的變化 模型組收縮壓顯著高于正常對照組(P<0.05)；阿托伐他汀鈣組血壓與模型組對比無明顯改變(P>0.05)；連續灌服當歸揮發油，當歸揮發油組(高、低)血壓明顯低于模型組(P<0.05)，當歸揮發油各組(高、低)差異明顯(P<0.05)。見表1。

2.2當歸揮發油對各組大鼠肝臟組織形態學的影響 正常對照組肝小葉結構正常，肝細胞正常。模型組可見脂肪變性，肝細胞內有小泡。與模型組相比，當歸組可見肝竇擴張。當歸揮發油高劑量組可見糖原分解，脂肪變性消失。阿托伐他汀鈣組未見明顯異常。見圖1。

2.3當歸揮發油對各組大鼠肝臟TRIB1、TLR3 mRNA水平表達的影響 與正常對照組(1.00±0.04，1.00±0.14)比較，TLR3、TRIB1在模型組(0.85±0.13，1.35±0.11)均未見明顯異常，TRIB1在當歸組(低、高)、阿托伐他汀鈣組表達上調(2.89±0.35，4.56±0.59，3.53±0.37)，且均差異性表達上調(P<0.05)，TRIB1在當歸揮發油組間亦為差異性表達上調(P<0.05)。TLR3在當歸組(低、高)及阿托伐他汀各組間表達上調(2.89±0.33，3.56±0.57，2.53±0.33)，但差異無統計學意義。

表1 當歸對SHR尾動脈收縮壓的影響

與正常對照組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.01

圖1 當歸揮發油對各組大鼠肝臟組織形態學的影響(HE,×400)

3 討 論

脂質代謝紊亂可以作為高血壓發病的危險因素，兩者常互為因果〔3〕，特別是在肥胖和老年人中表現明顯。當歸具有的降壓作用已經被證實〔3〕。近期在國內的文獻報道中也證實了當歸對高脂飲食誘導的小鼠模型脂代謝的作用〔4〕。在本課題小組以往的研究中，發現TLR3及TRIB1基因表達上調，并且是差異性的表達上調〔5〕，故推測當歸揮發油可能通過影響脂代謝進而抑制動脈硬化來達到降壓的目的。本次實驗繼續選用SHR為模型，阿托伐他汀鈣作為陽性對照藥物，既保證了與前期試驗的一致性，同時又有創新性。TLR3可以作為抑制動脈硬化的因子，TRIB1與血脂水平密切相關。TLR3作為介導天然免疫反應的一類模式識別受體，在動脈粥樣硬化中發揮著重要的作用。TLR3基因缺失后可以加快載脂蛋白(Apo)E缺陷的小鼠動脈粥樣硬化的進程，提示TLR3信號通路對血管壁可能存在保護作用〔6〕。TRIB1基因是近年來發現的一個新的基因，TRIB1基因多態性與血脂水平有關〔7〕。 Bauer等〔8〕發現在敲除小鼠的TRIB1基因后，小鼠體內甘油三酯含量增加，脂肪基因的轉錄生成加快和新生脂肪增多，TRIB1調節肝脂肪生成C/EBPa，通過轉錄后調控，進而轉錄上調TRIB1，提示TRIB1對肝臟的保護性作用。根據本研究結果推測，SHR在經過當歸揮發油的治療后，TLR3，TRIB1發生的上調變化可能通過某些信號通路或者轉導通路發生作用。

1孫雅遜，胡申江，張志杰，等.阿托伐他汀改善自發性高血壓大鼠的心肌脂質代謝和抑制心肌肥厚〔J〕.中華高血壓雜志，2006；14(8)：632-5.

2尹 輝.當歸化學成分及藥理活性研究進展〔J〕.重慶科技學院學報(自然科學版)，2015；17(1)：100-1，112.

3Stevens W，Penevat D，Li JZ，etal.Estimating the future burden of cardiovascular disease and the value of lipid and blood pressure control therapies in China〔J〕.BMC Health Serv Res，2016；16：175.

4Zhong T，Zhang H，Duan X，etal.Anti-obesity effect of radix Angelica sinensis and candidate causative genes in transcriptome analyses of adipose tissues in high-fat diet-induced mice〔J〕.Gene，2017；599(1)：92-8.

5伊 琳，趙 昕，李 屹.當歸對自發性高血壓大鼠腦組織Tnfaip8l2、Ahsg及Tlr3基因表達的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志，2013；21(10)：891-3.

6Baiersdrfer M，Schwarz M,Seehafer K,etal.Toll-like receptor 3 me-diates expression of clusterin/apolipoprotein J in vascular smooth muscle cells stimulated with RNA released from necrotic cells〔J〕.Exp Cell Res，2010；316(11):3489-500.

7Varbo A，Benn M，Tybjrg-Hansen A，etal.TRIB1 and GCKR polymorphisms，lipid levels，and risk of ischemic heart disease in the general population 〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011；31(2)：451-7.

8Bauer RC，Sasaki M，Cohen DM，etal. Tribbles-1 regulates hepatic lipogenesis through posttranscriptional regulation of C/EBPα〔J〕.J Clin Invest，2015；125(10)：3809-18.

Angelicanaphthaup-regulatingthegeneexpressionsofTLR3,TRIB1inspontaneouslyhypertensiverats

QUQiang,JILu-Feng,SHIXiang-Hui,etal.

CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,GansuUniversityofTraditionalChineseMedicine,Lanzhou730000,Gansu,China

ObjectiveTo observe the Chinese angelica naphtha on liver tissue TRIB1, TLR3 mNRA expression in spontaneously hypertensive rats (SHRs) and explore the effect of angelica naphtha on lipid metabolism and its mechanism.Methodsthe 8-week-old male SHR were randomly divided into model, low(5% angelica naphtha), high dose of angelica naphtha(10% angelica naphtha) and atorvastatin groups, and the Wistar rats with the same age were selected as normal control group. Changes of blood pressure were measured before and after 4 weeks of intragastric administration administration. Liver tissue was taken and HE staining was used to observe the structural changes.ResultsAngelica naphtha could reduce the blood pressure of SHRs. TRIB1, TLR3 expressions were up-regulated in treatment groups, and there were significant differences between different dose groups.ConclusionsAngelica naphtha plays a regulatory role in SHR lipid metabolism by raising the TRIB1, TLR3 mRNA expressions and thus inhibits atherosclerosis and affects lipid metabolism.

Angelica naphtha;Lipid metabolism;TRIB1;TLR3

國家自然科學基金(No.81460669)；甘肅省中醫藥管理局項目(GZK-2016-40)

伊 琳(1971-)，女，博士，副教授，主要從事中西醫結合心腦血管疾病的防治研究。

曲 強(1971-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事中西醫結合心腦血管疾病的防治研究。

R394.3

A

1005-9202(2017)20-4957-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.001

〔2017-03-17修回〕

(編輯 袁左鳴)