補瀉不同配伍補陰方對衰老大鼠抗氧化能力及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

徐 穎 梁紹棟 任公平 朱海夫 莊亞嚴 孫琳林

(牡丹江醫學院紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011)

補瀉不同配伍補陰方對衰老大鼠抗氧化能力及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

徐 穎 梁紹棟 任公平 朱海夫 莊亞嚴 孫琳林

(牡丹江醫學院紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011)

目的比較左歸丸和六味地黃丸及共有“三補”藥物組抗衰老的作用機制。方法觀察左歸丸和六味地黃丸及共有“三補”藥物組對D-半乳糖(D-gal)致亞急性衰老大鼠血清和腎組織的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量及對腎組織Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響。結果亞急性衰老大鼠SOD水平下降，MDA含量升高，Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平上調；對于血清中的SOD活性，左歸丸和六味地黃丸均有顯著的升高作用，“三補”的升高作用顯著；對于腎組織中的SOD活性，各給藥組均無升高作用；對于血清和腎組織中的MDA，三給藥組均有明顯的降低作用；兩補腎方和“三補”藥物組均有下調腎組織促凋亡因子Bax、Caspase-3蛋白表達和上調抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達的作用。結論兩補腎方可能是通過提高SOD活力、降低MDA含量和降低Bax、Caspase-3以及升高Bcl-2表達而達到延緩衰老的效果。左歸丸和六味地黃丸盡管存在補瀉配伍方式的不同，但在抗衰作用上差異不顯著；補瀉兼顧和純補無瀉的組方思想只是在具體的藥理機制上有所不同。

左歸丸；六味地黃丸；抗衰老

左歸丸和六味地黃丸是公認的抗衰經典方劑，均具有滋補腎陰的作用，在配伍上兩方均以“三補”為基礎，前者純甘壯水、陽中求陰，后者補中寓瀉、補瀉兼顧〔1〕。目前，兩方抗衰藥理作用的實驗研究較多，但在抗衰方面的研究還較少。本實驗觀察了左歸丸和六味地黃丸及兩方共有組分“三補”對D-半乳糖(D-gal)致亞急性衰老大鼠抗氧化能力和衰老相關因子蛋白表達的影響，并對兩方的作用進行了分析和比較。

1 材料與方法

1.1用藥及制備 六味地黃丸(熟地24 g、山藥12 g、山萸肉12 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g和澤瀉9 g)、左歸丸(熟地24 g、山藥12 g、山萸肉12 g、菟絲子12 g、龜板膠12 g、枸杞12 g、牛膝9 g和鹿角膠12 g)及“三補”藥物組(熟地24 g、山藥12 g和山萸肉12 g)，中藥飲片購自牡丹江醫學院附屬紅旗醫院草藥局，水煎后4℃冷藏保存，煎制后濃度左歸丸0.63 g/ml，六味地黃丸0.45 g/ml，“三補”藥物組0.29 g/ml。

1.2動物及分組 Wistar大鼠60只(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，雌雄各半，體重(300±20)g，體重區域化后隨機分為正常組、模型組、六味組、三補組和左歸組，每組12只。

1.3造模及給藥 根據《藥理實驗方法學》，選擇D-半乳糖致大鼠亞急性衰老模型〔1〕：將D-gal 15 g溶于生理鹽水500 ml中，配成30 mg/ml的濃度，按每日300 mg/kg給大鼠腹腔注射，正常組大鼠注射等體積生理鹽水，造模周期為8 w。各給藥組(即左歸組、六味組和三補組)于造模開始的同時按10 ml/kg每日上午分別給予上述煎煮好的相應治療藥物，正常組和模型組給生理鹽水，灌胃給藥，1次/d。各給藥組的給藥劑量分別為左歸組0.63 g/kg、六味組0.45 g/kg、三補組0.29 g/kg，給藥周期為8 w。8 w后各組大鼠斷頭取血，分離血清，按要求保存待測。

1.4指標及檢測 血和腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量，測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；腎臟組織Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達檢測免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。均按照試劑盒提供的方法及要求進行操作，免疫組化采用Motic Med 6.0彩色病理圖像分析系統進行分析和計數。

1.5統計學方法 采用SPSS22.0統計行單因素方差分析。

2 結 果

2.1對衰老大鼠血清和腎組織SOD的影響 模型組大鼠血清和腎臟組織中的SOD活力明顯低于正常組(P<0.01或P<0.05)。對血清中SOD的升高作用，六味組和左歸組與模型組相比具有顯著差異(P<0.01或P<0.05)，三補組的作用與模型組相比差異不顯著(P>0.05)；對腎組織中SOD的升高作用，各給藥組與模型組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2對衰老大鼠血清和腎組織MDA的影響 模型組大鼠MDA含量明顯高于正常組(P<0.01)。對于血清中MDA含量的降低作用，各給藥組與模型組相比均具有顯著差異(P<0.05或P<0.01)；對于腎組織中MDA含量的降低作用，各給藥組與模型組相比均有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

2.3對衰老大鼠腎臟組織Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影

響 模型組大鼠腎臟Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達明顯高于正常組(P<0.01)；各給藥組大鼠腎臟Bax、Caspase-3蛋白表達均降低，與模型組相比有顯著差異(P<0.05或P<0.01)；各給藥組大鼠腎臟Bcl-2蛋白表達升高，與模型組相比具有顯著性差異(P<0.01)。見表2，圖1。

表1 各組衰老大鼠SOD、MDA活性比較

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2 各組Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達比較

圖1 各組Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(DAB，×40)

3 討 論

衰老的氧化損傷與自由基學說認為，衰老是細胞內成分累積性氧化損傷的最終結果，機體內的抗氧化系統對細胞損傷的減輕起著至關重要的作用，SOD和MDA就是抗氧化系統中兩個非常重要的衡量指標〔2，3〕。在衰老過程中，細胞凋亡的發生亦十分關鍵，相關因子Bax、Bcl-2、Caspase-3均參與其中，并且抗凋亡因子Bax和促凋亡因子Bcl-2可共同激活促凋亡因子Caspase-3和其家族的其他因子，引起衰老的發生〔4，5〕。有研究顯示〔6〕，腎損傷發生過程中，氧化應激起至關重要的作用，因為其可以誘導細胞凋亡和自噬的發生。

祖國醫學認為腎虛是衰老的重要原因之一，腎為人體先天之本，藏精，主骨，生髓，通于腦，與衰老的發生密切相關。《素問·上古天真論》中提到女子“二七而天癸至……月事以時下故有子”，“七七……天癸竭，地道不通，故形壞而無子”；男子“二八腎氣盛天癸至……故能有子……八八天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極，則齒發去”。說明自古腎中精氣的盛衰即被認為是衰老發生的內在的根本性機制之一，因此，延年益壽中藥常具有補腎填精作用。現代對于中醫藥抗衰老的研究亦多是圍繞補腎抗衰的思路，大部分的經典補腎抗衰方均具有抗衰老的作用，如陳喬等〔7〕研究發現六味地黃丸可以改善老年大鼠的學習記憶能力，從而發揮抗衰老的作用。左歸丸和六味地黃丸均是補腎陰的經典代表方劑，從配伍上看，前者以純補無瀉為組方思路，后者為補瀉兼顧的全方特點，兩方均是公認的補腎抗衰方。本研究顯示兩補腎方和“三補”藥物組均有下調腎組織促凋亡因子Bax、Caspase-3蛋白表達的作用和上調抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達的作用；提高SOD活力、降低MDA含量和降低Bax、Caspase-3以及升高Bcl-2等衰老相關因子的蛋白表達，而達到延緩衰老的效果。由此分析，不同的配伍思路對于方劑的具體藥理作用可以產生不同的影響，但補瀉兼顧和純補無瀉的組方思想似乎對總體的抗衰藥理效果并未產生本質上的影響，只是在具體的藥理機制上有所不同。

1徐叔云，卞如濂.藥理實驗方法學〔M〕.北京：人民衛生出版社，2006：1464-6.

2Bei C，Yi Z，Wei P，etal.Age-related changes in the central auditory system：comparison of D-galactose induced aging rats and naturally aging rats〔J〕.Brain Res，2010；1344：43-53.

3曹伍林，付曉瑩，孟祥才，等.秋季全光照及水楊酸對人參葉片生理光合特性及人參皂苷類成分含量的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2016；22(1)：72-7.

4Van der Burgh R，Meeldijk J，Jongeneel L，etal.Reduced serpin B9-mediated caspase-1 inhibition can contribute to autoinflammatory disease〔J〕.Oncotarget，2016；15(3)：19265-71.

5任桂萍，衣春霖，楊永碧，等.FGF-21對D-gal誘導的小鼠肝臟氧化應激及凋亡保護機制研究〔J〕.東北農業大學學報，2015；46(8)：61-9.

6羅 康，樸尚國，金英順，等.細胞凋亡和細胞自噬在慢性環孢素A腎毒性中的作用〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(11)：3051-3.

7陳 喬，李征峰，李 青，等.六味地黃丸對老年大鼠學習記憶及腦內M1膽堿受體陽性神經元的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2013；19(3)：205-8.

ComparativestudybasedontheeffectoftheTonifyYinDecoctionwithdifferentmethodsofsupplementationanddrainingontheantioxidantcapacityandBax,Bcl-2andCaspase-3proteinexpressionsinagingrats

XUYing,LIANGShao-Dong,RENGong-Ping,etal.

HongqiHospitalAffiliatedtoMudanjiangMedicalCollege,HeilongjiangMudanjiang157011,Heilongjiang,China

ObjectiveTo analyze and compare the anti-aging function's mechanisms of the two invigorating yin formulas, Zuogui Pill and Liuweidihuang Pill.MethodsThe expressions of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in serum and kidney tissue, and the expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 protein in the kidney tissue of subacute aging rats induced by D-galactose were observed.ResultsThe level of SOD was reduced, the levels of MDA,the expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were increased in subacute aging rats. The activity of SOD in serum was stepped up significantly by Zuogui Pill, Liuweidihuang Pill, also, it was rised obviously by Sanbu group. But, there was no significant difference on the activity of SOD in kidney tissue among three groups. Wherever, the MDA in serum and kidney tissue was cut down significantly in three groups. The expressions of Bax and Caspase-3, pro-apoptotic factors were cut down and the expressions of Bcl-2, anti-apoptotic factors, were stepped up in the two tonifying kidney formulas and Sanbu group.ConclusionsThe thought of the combination of supplementation and draining and the pure supplement are only different in the specific pharmacological mechanism.

Zuogui pill;Liuweidihuang pill;Anti-aging

國家自然科學基金委員會資助項目(81403316)；黑龍江省自然科學基金項目(201494)；黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12531738)

孫琳林(1979-)，女，博士，副主任醫師，副教授，主要從事中西醫結合教學、臨床及科研工作研究。

徐 穎(1985-)，女，碩士，助教，住院醫師，主要從事中西醫結合教學、臨床及科研工作。

R2-03

A

1005-9202(2017)20-4974-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.008

〔2017-07-15修回〕

(編輯 徐 杰)