霉酚酸酯對阿霉素腎病大鼠血管內皮生長因子和轉化生長因子-β1表達的影響

鄒艷紅 李春玉 劉潔薇 王麗敏 張 權 聶 磊

(佳木斯大學附屬第一醫院兒科，黑龍江 佳木斯 154002)

1 佳木斯市中心醫院

霉酚酸酯對阿霉素腎病大鼠血管內皮生長因子和轉化生長因子-β1表達的影響

鄒艷紅 李春玉 劉潔薇 王麗敏 張 權1聶 磊

(佳木斯大學附屬第一醫院兒科，黑龍江 佳木斯 154002)

目的觀察霉酚酸酯(MMF)對阿霉素腎病大鼠血管內皮生長因子(VEGF)與轉化生長因子(TGF)-β1表達的影響。方法應用阿霉素制造腎病綜合征(NS)大鼠模型，將實驗動物隨機分為正常對照組、NS模型組、低劑量MMF干預組和高劑量MMF干預組。考馬斯亮藍方法檢測24 h各組尿蛋白水平，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測腎組織勻漿中VEGF、TGF-β1的含量。結果干預前NS模型組、低劑量MMF干預組和高劑量MMF干預組尿蛋白含量、腎組織中VEGF、TGF-β1的表達與正常對照組差異明顯(P<0.05)；MMF灌胃4、6、8 w后，低、高劑量MMF干預組尿蛋白含量、腎組織中VEGF、TGF-β1的表達較正常對照組、NS模型組均顯著降低(P<0.05)；高劑量MMF干預組尿蛋白含量、腎組織中VEGF、TGF-β1的表達與低劑量MMF干預組無明顯差異。結論MMF對大鼠NS的拮抗作用可能是通過下調TGF-β1和VEGF在腎組織中表達來實現的。

霉酚酸酯；阿霉素；血管內皮生長因子(VEGF)；轉化生長因子(TGF)-β1

腎病綜合征(NS)是各種病因引起的腎小球毛細血管通透性增高，從而生成大量蛋白尿的臨床癥候群。蛋白尿是NS最重要的病理生理改變，也是導致其他臨床表現的基本原因。霉酚酸酯(MMF)是一種新型、高效的免疫抑制劑，可強有力地抑制淋巴細胞增殖和異種抗原所誘導的細胞毒細胞的生成，因而在臨床廣泛應用于移植排斥的預防和治療。MMF能降低NS蛋白尿水平和減輕腎病病變的作用，但具體機制尚不明確〔1，2〕。本實驗觀察MMF是否通過調節血管內皮生長因子(VEGF)與轉化生長因子(TGF)-β1在大鼠腎組織中的表達而發揮其拮抗NS的作用。

1 材料與方法

1.1主要藥物、試劑和儀器 阿霉素注射液：浙江海正藥業股份有限公司(國藥準字H33021980)生產；MMF：上海羅氏制藥有限公司(國藥準字H20031240)生產；酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物有限公司；酶標儀：型號SAF-680T，國產。

1.2動物模型建立及分組 擇健康清潔級雄性SD大鼠50只，體重180～220 g，由本校動物中心提供，生產許可證號SCXK黑2008004。 造模前實驗動物適應性標準飼養3 d后，隨機分為正常對照組10只、NS模型組40只。阿霉素致NS大鼠模型的制備如下〔3〕：將大鼠在非麻醉狀態下固定于固定器中，一次性尾靜脈注射阿霉素7 mg/kg，阿霉素在臨用時用生理鹽水稀釋成2 mg/ml溶液。對照組用同種方法注射7 mg/kg生理鹽水。注射后分籠喂養，自由進食、進水。注射后1 w收集所有大鼠24 h尿液，進行24 h尿蛋白定量，尿蛋白>100 mg/24 h為模型成功。將造模成功的30只大鼠隨機分為NS模型組，低、高劑量MMF干預組，每組10只。低劑量MMF干預組每天給予8 mg/kg的MMF灌胃，高劑量MMF干預組每天給予10 mg/kg的MMF灌胃，1次/d；正常對照組和NS模型組給予等容積生理鹽水灌胃，共8 w〔4，5〕。

1.3大鼠24 h尿蛋白檢測 各組分別于干預前及MMF灌胃后 4、 6、 8 w末收集24 h尿液，4 000 r/min離心10 min后取上清，用考馬斯亮藍法檢測尿蛋白含量。

1.4腎組織VEGF、TGF-β1表達的檢測 應用ELISA檢測腎組織勻漿中VEGF、TGF-β1的含量。取腎組織10 mg左右置于冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，PBS的體積總量為腎組織重量的9倍。腎組織用眼科剪刀剪碎后倒入玻璃勻漿管中充分研磨，使組織勻漿化。勻漿用低溫離心機2 000 r/min 4℃離心10 min后取上清，ELISA檢測步驟按試劑盒說明書進行。

1.5統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組24 h尿蛋白水平比較 干預前NS模型組，低、高劑量MMF干預組尿蛋白含量與正常對照組差異顯著(P<0.05)；MMF灌胃4、6、8 w后，低、高劑量MMF干預組尿蛋白含量較正常對照組、NS模型組顯著降低(P<0.05)；高、低劑量MMF干預組無明顯差異。見表1。

2.2各組腎組織中VEGF、TGF-β1的表達 干預前NS模型組低、高劑量MMF干預組腎臟組織中VEGF、TGF-β水平較正常對照組明顯升高(P<0.05)；MMF灌胃4、6、8 w后，低、高劑量MMF干預組VEGF、TGF-β1水平較正常對照組、NS模型組顯著降低(P<0.05)；高劑量MMF干預組VEGF、TGF-β1水平與低劑量MMF干預組無明顯差異。見表1。

表1 各組尿蛋白含量、VEGF、TGF-β1水平比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與NS模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

MMF是一種新型、高效的免疫抑制劑，廣泛應用于移植排斥的預防和治療及系統性紅斑狼瘡、血管炎等免疫系統疾病〔6，7〕。此外，MMF還具有抗炎作用，能直接抑制系膜細胞增殖、黏附分子的表達及許多細胞因子的產生等。有研究表明，MMF可緩解糖尿病腎病的進程，降低糖尿病大鼠的蛋白尿含量。其機制可能是通過抑制毒性細胞增殖、降低淋巴細胞黏附分子表達，減少對內皮血管的損傷而起到保護腎臟的作用〔8，9〕。TGF-β1對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節作用，TGF-β超家族是目前公認的促進腎臟疾病發展的主要細胞因子。研究表明NS患者和實驗動物血、尿及腎組織中TGF-β1水平均明顯高于正常對照組〔10，11〕。TGF-β1水平變化可作為反映腎纖維化程度、NS病情、判斷病理類型及評價激素治療敏感與否的指標。VEGF在正常腎臟組織中也有所表達，主要分布于腎小管細胞和腎小球足細胞中，具有增加腎臟血管通透性、促進內皮細胞分裂及增殖等作用。在缺氧、高血壓、血管緊張素、高血糖等條件作用下，VEGF過表達而導致腎臟功能的損傷〔12〕。此外，研究發現TGF-β1可促進VEGF生成，TGF-β1刺激新生血管的形成是全部或部分通過VEGF來實現的〔13〕。

MMF對改善NS尿蛋白水平可能是通過下調TGF-β1和VEGF在腎組織中的表達來實現的〔14〕，但具體作用機制及TGF-β1和VEGF之間的相互作用機制還需進一步研究。

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13Saravanan S，Pari L.Protective effect of thymol on high fat diet induced diabetic nephropathy in C57BL/6J mice〔J〕.Chem Biol Interact，2016；245(5)：1-11.

14鄒艷紅，王海燕.血管內皮生長因子與腎臟疾病相關研究進展〔J〕.中國誤診學雜志，2010；10(10)：6822-3.

黑龍江省教育廳項目(No.2016-KYYWF-0606)

聶 磊(1977-)，男，醫學碩士，副主任醫師，主要從事神經系統疾病研究。

鄒艷紅(1978-)，女，醫學碩士，主治醫師，主要從事腎病機制的研究。

R692

A

1005-9202(2017)20-4976-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.009

〔2016-10-22修回〕

(編輯 苑云杰)