siRNA TPM4對肺癌細胞增殖凋亡的影響

何建林 李 玨 楊 娜

(云南省第二人民醫院呼吸內科，云南 昆明 650021)

1 胸外科

siRNA TPM4對肺癌細胞增殖凋亡的影響

何建林 李 玨1楊 娜

(云南省第二人民醫院呼吸內科，云南 昆明 650021)

目的探討原肌球蛋白(TPM)4小干擾RNA(siRNA TPM4)對肺癌細胞增殖凋亡的影響。方法以人肺癌細胞A549為研究對象，細胞轉染TPM4 siRNA(TPM4 siRNA組)、siRNA control(siRNA control組)，同時設置對照組，對照組中只加入轉染試劑。培養48 h后，Western印跡檢測細胞TPM4、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2的表達水平，噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果siRNA control組細胞中TPM4、Cleaved Caspase-3、Bcl-2表達水平及細胞存活率、細胞凋亡率與對照組相比均無明顯差異(P>0.05)。TPM4 siRNA組細胞中TPM4表達水平及細胞存活率均明顯低于對照組(P<0.01)。TPM4 siRNA組細胞中Cleaved Caspase-3表達水平及細胞凋亡率均明顯高于對照組，而Bcl-2明顯低于對照組(P<0.01)。結論TPM4 siRNA能夠抑制肺癌細胞增殖，促進肺癌細胞凋亡。

肺癌；增殖；凋亡；原肌球蛋白4

據統計，肺癌的發病率在男性全部惡性腫瘤中位居第一，在女性全部惡性腫瘤中位居第3位〔1〕。常見的治療肺癌的方法是手術治療、放療和化療。原肌球蛋白(TPM)是一種廣泛存在于哺乳動物體內的肌肉調節相關蛋白。TPM4是TPM家族的成員之一，與腫瘤的發展有關〔2〕。研究表明，TPM4在乳腺癌、肺癌、結直腸癌、膠質瘤、膀胱癌等多種癌癥中均過度表達〔3〕。下調結直腸癌細胞中的TPM4表達能抑制結直腸癌細胞的增殖，促進結直腸癌細胞凋亡〔4〕。本研究旨在探討TPM4對肺癌細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細胞 人肺癌細胞A549購自中國科學院細胞庫。

1.2主要儀器及試劑 二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、噻唑藍(MTT)均購于美國Sigma；胎牛血清購于美國Gibco；TPM4單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)單克隆抗體、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購于美國CTS；LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑購于美國Invitrogen；流式細胞儀購于美國Thermo。

1.3細胞培養 取出保存在液氮灌中的肺癌細胞A549，迅速放在37℃融化后，用含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM細胞培養液懸浮細胞后，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入5 ml細胞培養液重懸細胞，接種到細胞培養瓶中，放置于37℃，飽和濕度，5% CO2培養箱中培養，觀察細胞融合度超過85%時，倒掉細胞培養液，加入0.25%的胰蛋白酶，放在37℃消化2 min，加入適量的細胞培養液，根據實驗要求按照不同比例接種到細胞培養瓶中繼續培養。

1.4細胞轉染 取接種于6孔細胞培養板中且細胞濃度為70%的人肺癌細胞A549，分為對照組、TPM4 siRNA組、siRNA control組。根據實驗要求，把Opti-MEM Reduced serum Medium 和MAX按照體積比為40∶1的比例混合為A液，將TPM4 siRNA、siRNA control分別與Opti-MEM Reduced serum Medium混合后為B液，將A液與B液混合，放置于室溫條件下反應20 min。取濃度為70%的人肺癌細胞A549，吸除上清液，每孔中加入Opti-MEM Reduced serum Medium 2 ml孵育20 min。取A液與B液的混合物加入到細胞中，放在37℃，5% CO2培養箱中培養4 h后，更換細胞培養液繼續培養。

1.5Western印跡檢測轉染后細胞中TPM4表達水平 取轉染后培養48 h的人肺癌細胞A549，加入蛋白抽提試劑，放在冰上裂解20 min。將裂解液轉移至離心管中，4℃，12 000 r/min離心15 min。移液槍吸取蛋白上清至EP管中，BCA蛋白濃度檢測試劑盒對提取的蛋白定量。將提取的蛋白與5倍上樣緩沖液按照體積比為4∶1的比例混合，放置在100℃的孵育器中反應5 min后，按照每孔50 μl變性蛋白樣品加入到聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，80 V電壓電泳30 min后，觀察溴酚藍進入分離膠和濃縮膠邊緣時，120 V電壓至電泳結束。取出蛋白凝膠4℃轉印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，依次與一抗(500倍稀釋，4℃孵育過夜)、二抗(2 000倍稀釋，37℃反應2 h)孵育后，滴加顯色液，以GAPDH為內參，Image圖像分析軟件分析蛋白表達含量。

1.6MTT檢測細胞增殖 取轉染后的人肺癌細胞A549，胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度使每毫升細胞懸浮液中含有1×105個細胞，按照每孔100 μl細胞懸浮液接種到96孔細胞培養板中培養48 h，每組設置5個復孔，同時設置空白組，空白組中不加細胞。加入5 mg/ml的MTT溶液，放在CO2培養箱中孵育反應4 h。吸除上清液，加入二甲基亞砜溶液150 μl，在避光環境中孵育10 min，酶標儀檢測每孔的吸光度。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡 取轉染后的人肺癌細胞A549，胰蛋白酶消化后，收集1×106個細胞，用冰預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，加入結合緩沖液充分混合后，加入碘化丙啶(PI)和膜聯蛋白-V-FITC(Annexin-V-FITC)各5 μl，放置于避光條件下孵育反應20 min，加結合緩沖液400 μl，流式細胞儀檢測細胞凋亡。同時用Western印跡檢測轉染48 h后的人肺癌細胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2的表達水平，步驟同1.5。

1.8統計學方法 應用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1轉染后細胞中TPM4表達檢測結果 siRNA control組細胞中TPM4表達水平(0.58±0.07)與對照組(0.58±0.06)無顯著差異(P>0.05)，TPM4 siRNA組(0.12±0.08)無明顯低于對照組(P<0.01)。見圖1。

2.2細胞增殖檢測結果 siRNA control組細胞存活率〔(99.89±1.49)%〕與對照組〔(100.24±1.06)%〕相比無顯著差異(P>0.05)，TPM4 siRNA組〔(62.34±1.15)%〕明顯低于對照組(P<0.01)。

2.3細胞凋亡檢測結果 siRNA control組細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、Bcl-2水平與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。TPM4 siRNA組細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3水平均明顯高于對照組(P<0.01)，Bcl-2水平明顯低于對照組(均P<0.01)。見圖2，表1。

圖1 轉染后細胞中TPM4表達水平

圖2 細胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2表達檢測結果

組別凋亡率(%)CleavedCaspase?3Bcl?2對照組1120±132035±004051±006siRNAcontrol組1117±212035±005050±008TPM4siRNA組3247±1021)082±0081)029±0071)

與對照組比較：1)P<0.01

3 討 論

多種因素均能引起肺癌的發生，而且肺癌早期臨床癥狀不明顯，多數患者確診時已經是肺癌晚期。TPM4是近年來研究發現的與腫瘤發展有關的一種與肌肉收縮有關的調節蛋白〔5〕。TPM4參與調控宮頸癌、肺癌、舌鱗癌、骨肉瘤、前列腺癌等多種癌細胞的生長〔6〕。干擾結直腸癌細胞中的TPM4表達后，結直腸癌細胞凋亡增多〔4〕。

細胞增殖和凋亡是一個動態平衡的過程。在某系病理因素作用下，這種動態平衡被打破，引起疾病的發生。細胞凋亡受多種因子共同調控。Caspase是一種與細胞凋亡相關的蛋白家族，在真核細胞凋亡過程中發揮關鍵作用〔7〕。正常情況下，細胞內的Caspase前體沒有活性，在蛋白酶的作用下被激活，從而特異性的水解底物，引起細胞凋亡〔8〕。Caspase-3是Caspase級聯反應中的效應因子，其激活標志著細胞凋亡進入不可逆階段〔9〕。Bcl-2蛋白家族是與細胞凋亡相關的另一蛋白家族，Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的成員之一，在細胞凋亡過程中發揮抑制作用〔10〕。有研究表明，癌細胞凋亡過程中，Caspase-3過度活化，Bcl-2表達下調〔11〕。本研究結果提示，干擾TPM4 能夠抑制人肺癌細胞增殖，促進人肺癌細胞凋亡。

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4趙月鳴.TPM4 在結直腸癌中的表達及其生物學意義〔D〕.長春：吉林大學,2015.

5尤 玲.TPM4 在大鼠脊髓全橫斷可塑性中的作用研究〔D〕.昆明：昆明醫科大學,2014.

6Vasiljevic N,Ahmad AS,Carter PD,etal.DNA methylation of PITX2 predicts poor survival in men with prostate cancer〔J〕.Biomark Med,2014;8(9):1143-50.

7崔永亮,蔣軍廣,譚偉麗,等.凋亡相關基因 caspase-8 在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(9):2431-2.

8景曉平,程偉偉,何 麗.白藜蘆醇對 MGC803 細胞凋亡因子 Bad,p-Bad,Caspase-3 的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2016;22(5):147-50.

9梁曉飛,王 銘,肖永紅.粉防己堿對小鼠肺成纖維細胞的凋亡及 Caspase-3 蛋白的影響〔J〕.中國臨床藥理學雜志,2016;32(6):531-3.

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11Jing Z,Heng W,Xia L,etal.Downregulation of phosphoglycerate dehydrogenase inhibits proliferation and enhances cisplatin sensitivity in cervical adenocarcinoma cells by regulating Bcl-2 and caspase-3〔J〕.Cancer Biol Ther,2015;16(4):541-8.

云南省科技計劃項目(No.2014FB054)

何建林(1978-)，男，主治醫師，主要從事呼吸重癥方面研究。

R734.2

A

1005-9202(2017)20-5003-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.021

〔2017-04-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)