結腸癌組織中Beclin1、p62的表達及與臨床病理特征的關系

賴人旭 麥 蕾 高敏照 任江南 茍新敏 郭惠學

(中山大學附屬第五醫院消化內科，廣東 珠海 519000)

1 中山大學附屬第五醫院病理科

·腫瘤·

結腸癌組織中Beclin1、p62的表達及與臨床病理特征的關系

賴人旭 麥 蕾 高敏照 任江南 茍新敏1郭惠學

(中山大學附屬第五醫院消化內科，廣東 珠海 519000)

目的探討結腸癌患者組織中Beclin1、p62的表達水平及其與臨床病理特征的關系。方法選取2013年1月至2015年12月中山大學附屬第五醫院病理科保存的78例手術切除結腸癌組織標本，并以癌旁正常黏膜組織(距離病灶組織>5 cm)標本作為對照，采用免疫組織化學法檢測兩組組織標本中Beclin1、p62的表達水平，分析其與臨床病理特征的關系。結果結腸癌組織中Beclin1陽性表達率低于癌旁正常黏膜組織，p62陽性表達率高于癌旁正常黏膜組織(P<0.05)。腫瘤直徑≥5 cm、低分化、Ⅲ+Ⅳ期、腸壁浸潤深度T3～T4、有遠處淋巴結轉移結腸癌組織中Beclin1陽性表達率更低，p62陽性表達率更高，差異有統計學意義(P<0.05)。Spearman秩相關分析顯示結腸癌組織中Beclin1與p62呈負相關關系(r=-0.571，P=0.012)。結論Beclin1在結腸癌組織中呈低表達水平，p62呈高表達水平，可能參與了結腸癌的發生、發展過程，聯合檢測可作為早期輔助診斷結腸癌及評估預后的重要指標。

結腸癌；Beclin1；p62

大多結腸癌患者在確診時已接近中晚期，手術切除聯合術后放、化療是目前臨床治療結腸癌的常見手段。但患者預后較差，術后易發生淋巴結轉移，5年生存率較低〔1〕。研究表明〔2〕，細胞自噬在惡性腫瘤的發生、發展過程中有重要作用。Beclin1是位于人17號染色體上的與自噬有關的基因，介導了腫瘤細胞的自噬、凋亡、分化過程。研究顯示Beclin1可評估局部晚期結腸癌的預后〔3〕。p62是在胞質中合成，定位于細胞核中的磷酸化蛋白，研究發現p62表達增強與自噬抑制有關，其作為自噬標志物參與了自噬降解和自噬抑制過程〔4〕。本研究旨在探討Belcin1、p62在結腸癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013年1月至2015年12月中山大學附屬第五醫院病理科保存的78例手術切除的結腸癌組織標本，納入標準：①組織標本經活檢證實為結腸癌；②術前未經任何放、化療治療。排除標準：①心臟功能不全者；②肝腎功能障礙者；③合并其他惡性腫瘤；④合并其他可能影響本研究結果的疾病。其中男45例，女33例；年齡52～77〔平均(63.5±4.9)〕歲；腫瘤直徑：<5 cm 38例，≥5 cm者40例；組織學分型：腺癌45例，黏液腺癌33例；分化程度：低分化29例，中高分化49例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期43例，Ⅲ+Ⅳ期35例；腸壁浸潤深度：T1～T2 37例，T3～T4 41例；有遠處淋巴結轉移36例，無遠處淋巴結轉移42例。并以癌旁正常黏膜組織(距離惡性腫瘤位置>5 cm)標本作為對照。所有組織標本均采用濃度為4%的多聚甲醛固定保存。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器 美國AB-CAM公司提供的一抗Beclin1兔多抗、p62鼠單抗，稀釋為1∶100。鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(Ultra Sensitive TMSP)超敏試劑盆、檸檬酸組織抗原修復液和DAB顯色試劑盒均購于福州邁新公司。德國LEICA公司提供的HI-1220型烘片機，RM-2245型組織切片，HI-1210型展片臺。

1.2.2免疫組化染色 采用免疫組化SP法對結腸癌組織、癌旁正常黏膜組織中的Beclin1、p62表達水平進行檢測：分別取各自經濃度4%的多聚甲醛固定3 d的組織標本，采用磷酸緩沖液(含20%～30%蔗糖)梯度脫水后將其置于-20℃的冰凍切片機上連續切片，并進行免疫組化染色，再以二甲苯進行脫蠟處理，并酒精梯度脫水，在3%的過氧化氫，溫度為27℃的環境下孵育10 min，將內源性過氧化物酶滅活，滴加一抗過夜處理，在滴加經生物素標記的二抗后于27℃環境下孵育1 h，最后滴加經辣根過氧化酶標記的鏈霉素卵白素工作液，再以二氨基聯苯胺(DAB)顯色后以蘇木素復染，封片后在顯微鏡下觀察染色結果。

1.3結果判定 Beclin1陽性判斷標準：Beclin1主要在細胞質中呈棕黃色顆粒，陰性則為淡藍色樣的核樣結果；p62陽性判斷標準：p62在細胞質中呈棕黃色顆粒。在每個高倍視野(×400)下讀取Beclin1、p62陽性染色細胞的數量，連續讀5個高倍視野，并取平均值；染色細胞強度評分：0分為無染色，1分為淡黃色顆粒，2分為黃色顆粒，3分為棕黃色顆粒；染色細胞比例評分：陽性染色細胞數<25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，≥76%為3分；染色細胞強度評分與染色細胞比例評分相加評價最終結果：陰性(-)計0分，弱陽性(+)計1～2分，中強陽性()計3～4分，強陽性()計5～6分〔5〕。陽性率=(+)+()+()/總例數×100%。

1.4統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t、χ2檢驗、Spearman秩相關分析。

2 結 果

2.1結腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中Beclin1、p62表達水平比較 結腸癌組織中Beclin1、p62陽性表達率分別為26.92%(-57例，+11例，7例，3例)、62.82%(-29例，+29例，13例，7例)，癌旁正常黏膜組織中分別為71.79%(-22例，+29例，15例，12例)、21.79%(-61例，+10例，5例，2例)，結腸癌組織中Beclin1陽性表達率低于癌旁正常黏膜組織，p62陽性表達率高于癌旁正常黏膜組織(χ2=31.415,26.893；均P=0.000)。

2.2結腸癌組織中Beclin1、p62陽性表達與臨床病理特征的關系 腫瘤直徑≥5 cm、低分化、Ⅲ+Ⅳ期、腸壁浸潤深度T3～T4、有遠處淋巴結轉移結腸癌組織中Beclin1陽性表達率低于腫瘤直徑<5 cm、中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、腸壁浸潤深度T1～T2、無遠處淋巴結轉移結腸癌組織，腫瘤直徑≥5 cm、低分化、Ⅲ+Ⅳ期、腸壁浸潤深度T3～T4、有遠處淋巴結轉移結腸癌組織中p62陽性表達率高于腫瘤直徑<5 cm、中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、腸壁浸潤深度T1～T2、無遠處淋巴結轉移結腸癌組織(P<0.05)，結腸癌組織中Beclin1、p62陽性表達率與年齡、組織學分型無關(P>0.05)。見表1。

2.3結腸癌組織中Beclin1與p62相關性分析 結腸癌組織中Beclin1與p62呈負相關關系(r=-0.571，P=0.012)；其中Beclin1-,且p62-23例，p62+34例；Beclin 1+,且p62-6例，p62+15例。

表1 結腸癌組織中Beclin1、p62陽性表達與臨床病理特征的關系〔n(%)〕

3 討 論

結腸癌主要發生于直腸及直腸與乙狀結腸交界處，多發于男性。結腸癌早期主要行手術切除，但術后患者易復發和發生周圍淋巴結轉移，而病理分期晚、分化程度較低、淋巴結轉移等臨床病理特征是影響預后的主要因素〔6〕。

自噬即為自體吞噬，是在自噬相關基因的調控下，細胞利用溶酶體對自身衰老的線粒體、內質網及異常蛋白等“異常結構”消化降解的過程。自噬可預防病原微生物的侵入感染、腫瘤、神經退行性病變等，是細胞適應內外環境所需要的基本調節方式〔7〕。Utaipan等〔8〕研究表明，腫瘤組織中自噬作用明顯低于正常組織；Sun等〔9〕實驗表明，致癌物質對鼠胰腺細胞誘導后，癌癥前期的腺瘤、結節自噬能力增加，但形成癌細胞以后自噬能力降低。上述結果表明，自噬與惡性腫瘤的發生、發展過程密切相關。Beclin1蛋白可與ClassⅢPI3K結合，以復合物的形式介導自噬體的形成，是自噬的整形調節基因。研究表明〔10〕，結直腸癌組織、胃癌組織中Beclin1 mRNA表達水平較癌旁組織顯著下降，同時Beclin1蛋白水平也明顯降低。P62蛋白由N端Phox和Beml結構域、C端的泛素相關結構域及中間段的鋅指結構域3個結構組成，它能夠與泛素化蛋白結合，并通過與LC3蛋白結合以復合物的形式促進蛋白轉入自噬溶酶體內發生降解，自噬發生表明蛋白不斷降解，p62逐漸降低，反之，自噬發生缺陷時，p62聚集，表達水平明顯升高，因此，p62可作為自噬活性的重要標志蛋白〔11〕。

本研究結果提示Beclin1在結腸癌組織中表達水平降低，p62在結腸癌組織中表達水平升高，可能參與了結腸癌的發病過程，兩種指標可作為臨床早期輔助診斷結腸癌的重要指標。趙堅培等〔10〕研究結果顯示Beclin1 mRNA在結腸癌組織中的表達水平低于癌旁在組織，并證實自噬活性在結腸癌發病過程中明顯降低。Park等〔12〕發現結腸癌組織中p62明顯聚集，降解受阻。腫瘤大小、分化程度、TNM分期、浸潤深度及淋巴結轉移等臨床病理特征與患者病情進展密切相關，同時也是評價患者預后的重要參考指標，腫瘤體積越大、分化越低、TNM分期越晚、浸潤深度越深及有遠處淋巴結周圍轉移的患者，病情越嚴重，預后越差。本研究結果提示Beclin1、p62可能參與了結腸癌的發生、發展過程，可作為早期評估患者病情的重要指標。進一步采用Spearman秩相關分析，結腸癌組織中Beclin1與p62呈負相關性，可能與Beclin1水平降低引起自噬活性降低，從而導致自噬底物p62的大量聚集，進而通過介導NF-κB信號途徑而致細胞發生癌變有關。提示聯合檢測Beclin1和p62有助于早期評估患者病情，進而評估患者預后。

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4Petherick KJ,Williams AC,Lane JD,etal.Autolysosomal beta-catenin degradation regulates Wnt-antophagy-p62 crosstalk〔J〕.EMBO J,2013;32(13):1903-16.

5任宇鵬,宋 純,張 昊,等.結腸癌組織中 Beclin1及 Bcl-2表達變化及意義〔J〕.山東醫藥,2015；55(8):34-6.

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11Schl?fli AM,Adams O,Galván JA,etal.Prognostic value of the autophagy markers LC3 and p62/SQSTM1 in early-stage non-small cell lung cancer〔J〕.Oncotarget,2016;7(26):39544-55.

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賴人旭(1967-)，男，博士，副主任醫師，主要從事消化腫瘤的診斷和治療研究。

R73

A

1005-9202(2017)20-5059-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.047

〔2017-03-21修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)