尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白和腎損傷分子-1在流行性出血熱合并急性腎損傷早期診斷中的價值研究

劉 雷，徐 璐，魏明明，王 棟，張宜明，李新建

·論著·

尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白和腎損傷分子-1在流行性出血熱合并急性腎損傷早期診斷中的價值研究

劉 雷，徐 璐，魏明明，王 棟，張宜明，李新建*

目的探討尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)和腎損傷分子-1(KIM-1)在流行性出血熱(EHF)合并急性腎損傷(AKI)早期診斷中的價值。方法選取2014年1月—2016年11月濟寧醫學院附屬醫院腎內科、ICU、呼吸科及血液科收治的符合納入排除標準的41例EHF患者。根據AKI的診斷標準，將患者分為非AKI組和AKI組，收集兩組確診時、確診后不同時間點的血清肌酐(Scr)、尿NGAL、尿KIM-1水平。采用受試者工作特征(ROC)曲線評價尿NGAL和尿KIM-1對EHF合并AKI的早期診斷價值。結果41例EHF患者中，合并AKI者26例(63.4%)。兩組患者確診時Scr、確診時尿KIM-1水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；兩組患者Scr水平在確診后24、48、72 h比較，差異有統計學意義(P<0.05)；尿NGAL水平在確診時及確診后2、4、8、12、24 h比較，差異有統計學意義(P<0.05)；尿KIM-1水平在確診后2、4、8、12、24 h比較，差異有統計學意義(P<0.05)。Pearson相關分析顯示，確診后2 h尿KIM-1水平、確診后2 h尿NGAL水平與確診后24 h Scr水平呈正相關(r值分別為0.673、0.846，P<0.01)。確診后2 h尿NGAL診斷EHF合并AKI的ROC曲線下面積為0.822〔95%CI(0.692，0.952)〕，截點值為40.15 pg/ml；確診后2 h尿KIM-1的曲線下面積為0.785〔95%CI(0.643，0.927)〕，截點值為0.55 pg/ml。結論尿NGAL和尿KIM-1可能可以作為EHF患者是否合并AKI的早期診斷標志物。

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白；腎損傷分子-1；流行性出血熱；急性腎損傷

流行性出血熱(epidemic hemorrhagic fever，EHF)又稱腎綜合征出血熱，是由漢坦病毒引起的急性傳染病。在臨床上常有發熱、出血及腎臟損害，病理檢查可見廣泛的毛細血管損傷和微血栓形成[1]。EHF合并的急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)程度輕重不一，但始終貫穿疾病的始終，這是我國EHF患者的特點[2]，也是導致患者死亡的主要原因[3]。如何早期識別和診斷AKI是改善患者不良預后的重要手段之一。目前臨床上采用的傳統的AKI診斷標志物——血清肌酐(serum creatinine，Scr)或尿量在診斷時間上往往存在一定滯后性，有礙于臨床的早期預防和干預[4]。近年來，早期預測AKI發生的生物學標志物已成為AKI研究領域的熱點，其中包括一些反映腎小管損傷的指標，如血清中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)和腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)[5]。目前尚少見有關尿NGAL和尿KIM-1與EHF合并AKI關系的研究，本研究通過檢測EHF合并AKI患者的尿NGAL和尿KIM-1水平，探討其在EHF合并AKI早期診斷中的價值，以期為臨床的早期診斷提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2014年1月—2016年11月濟寧醫學院附屬醫院腎內科、ICU、呼吸科及血液科收治的EHF患者41例。納入標準：(1)確診為EHF，診斷標準為患者血清漢坦病毒抗體陽性，且抗體滴度4倍以上升高[1]；(2)年齡≥18歲；(3)無基礎腎臟疾病。排除標準：(1)入院前已發生AKI；(2)近期接受造影劑檢查、使用過腎毒性藥物；(3)拒絕參加本研究者。AKI的診斷標準：(1)48 h內Scr升高≥28.6 μmol/L；(2)Scr升高超過基礎值的1.5倍及以上，且明確或者經推斷上述情況發生在7 d之內；(3)尿量減少，即尿量<0.5 ml·kg-1·h-1，時間持續6 h以上。符合以上情況之一者即可診斷[6]。根據AKI診斷標準，將所有患者分為非AKI組和AKI組。所有入選患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 收集EHF患者的基本資料，包括性別、年齡、血紅蛋白、清蛋白及丙氨酸氨基轉移酶。收集患者確診時及確診后24、48、72 h的靜脈血標本2 ml，采用酶促法檢測Scr水平。收集患者確診時、確診后2、4、8、12、24 h的新鮮尿液標本15 ml，3 000 r/min離心5 min后取上清液置于Eppendorf管，-80 ℃保存，采用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)測定NGAL、KIM-1水平。試劑盒由美國R&D公司生產，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，均經復孔后取均值。

2 結果

2.1 患者的基本資料 41例EHF患者中，男29例(70.7%)；年齡18～72歲，平均年齡(51.0±12.7)歲；合并AKI者26例(63.4%)。確診EHF時，患者血紅蛋白水平為(144±13)g/L，清蛋白水平為(34.0±3.2)g/L，丙氨酸氨基轉移酶水平為(137±77)U/L。

2.2 非AKI組與AKI組患者基本資料及Scr、尿NGAL、KIM-1水平比較 兩組患者年齡、血紅蛋白、清蛋白、丙氨酸氨基轉移酶、確診時Scr、確診時尿KIM-1水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；兩組性別比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組Scr水平在確診后24、48、72 h比較，差異有統計學意義(P<0.05)；尿NGAL水平在確診時及確診后2、4、8、12、24 h比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；尿KIM-1水平在確診后2、4、8、12、24 h比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 非AKI組與AKI組患者基本資料及Scr、尿NGAL、KIM-1水平比較

注：AKI=急性腎損傷，Scr=血清肌酐，NGAL=中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，KIM-1=腎損傷分子-1；a為χ2值

2.3 尿NGAL、KIM-1與Scr的相關性 Pearson相關分析顯示，確診后2 h尿KIM-1水平、確診后2 h尿NGAL水平與確診后24 h Scr水平呈線性正相關(r值分別為0.673、0.846，P<0.01)。

2.4 尿NGAL和尿KIM-1診斷EHF合并AKI的 ROC曲線 確診后2 h尿NGAL診斷EHF合并AKI的曲線下面積為0.822〔95%CI(0.692，0.952)〕，截點值為40.15 pg/ml；確診后2 h尿KIM-1的曲線下面積為0.785〔95%CI(0.643，0.927)〕，截點值為0.55 pg/ml(見圖1)。

注：EHF=流行性出血熱，AKI=急性腎損傷，NGAL=中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，KIM-1=腎損傷分子-1

圖1 尿KIM-1和尿NGAL診斷EHF合并AKI的受試者工作特征曲線

Figure1 ROC curve of urine KIM-1 and NGAL for diagnosing EHF with AKI

3 討論

EHF基本病理變化是全身小血管及毛細血管廣泛損傷，在此基礎上可引發全身各組織器官及多系統的損傷和功能障礙[1]?；颊叩呐R床經過相差甚大，但均有不同程度的腎臟損傷，輕者僅有一過性蛋白尿，50%～60%的患者可出現AKI[7]。合并AKI時大多病情危重，治療困難，是EHF患者死亡的主要原因之一[3]。因此，及早發現并及時、有效的治療AKI，是提高EHF合并AKI治愈率的關鍵。

目前對于AKI的診斷標準仍以Scr和尿量的變化為依據，但由于Scr水平受性別、年齡、藥物及肌肉等的影響，尿量受血容量及利尿藥的影響，且這兩項指標在診斷時間上往往存在一定滯后性，故單純靠Scr和尿量來作為AKI的診斷標準，無法提供臨床干預的最佳時機，會延誤治療，增加了住院患者的住院時間和經濟負擔，故迫切需要靈敏度和特異度高的生物標志物[8-9]。目前研究較多的血清和尿生物標志物有NGAL、KIM-1 及胱抑素C等[10-11]，較傳統指標在早期診斷、評估嚴重程度及預后方面有一定的優勢。

NGAL是屬于載脂蛋白超家族的一員，正常情況下，NGAL在腎組織中微弱表達[12]。近期，ASSADI等[13]觀察了86例循環衰竭的兒童，發現尿NGAL在患兒入院時即開始升高，一直持續到第6天，尿NGAL預測兒童循環衰竭合并AKI的ROC曲線下面積為0.77，明顯早于Scr的升高。MISHRA 等[14]在缺血再灌注鼠腎損傷模型中發現，尿NGAL在腎受損后 2 h 即可檢測到，而此時的Scr仍為正常。YAN等[15]在探討尿NGAL和白介素18(IL-18)對膿毒血癥患者并發AKI的早期診斷價值中發現，AKI患者在膿毒血癥確診后2 h尿NGAL水平開始明顯升高，尿NGAL診斷AKI的ROC曲線下面積為0.93。MELNIKVO等[16]觀察了20例行心臟分流術后發生AKI的患者，發現術后2 h尿中NGAL水平明顯升高，而Scr在滯后1～3 d才開始升高，當以50 μg/L作為截點值時，尿NGAL檢出AKI的靈敏度和特異度分別為100%和98%。以上研究結果顯示NGAL在腎損傷發生后很短時間內迅速升高，比Scr有好的靈敏度和特異度。本研究中，AKI組尿NGAL指標在確診時及確診后2、4、8、12、24 h與非AKI組均有差異，確診后2 h尿 NGAL預測 EHF合并AKI 的 ROC 曲線下面積為 0.822，截點值是40.15 pg/ml。

KIM-1是一種Ⅰ型跨細胞膜糖蛋白，其存在于CD4+T細胞核腎近曲小管上皮細胞內，又被稱為T細胞免疫球蛋白和黏蛋白分子1或A型肝炎病毒細胞受體I[17-18]。KIM-1在正常腎組織中表達水平極低，但在腎損傷因素的作用下，可特征性升高，表達于腎損傷的腎小管上皮細胞頂膜并持續到細胞損傷完全修復；而完全萎縮的腎小管則不表達[19-20]。HAN等[17]研究發現，AKI患者的尿液中可檢測到KIM-1，且在腎缺血損傷發生后12 h升高，比尿顆粒管型出現得更早。此外，HAN等[21]以接受心臟外科手術患兒為研究對象對KIM-1與 AKI 的關系進行了研究，結果發現無論 AKI 患兒還是非 AKI 患兒尿 KIM-1 水平都明顯升高，手術后 12 h 尿 KIM-1水平預測 AKI 的 ROC 曲線下面積為 0.83。LUO等[22]研究了慶大霉素引起的中毒性腎損傷時KIM-1的變化，體外試驗發現，血KIM-1的mRNA在給藥后第1天就明顯表達，免疫組化顯示KIM-1在腎臟外髓部外層及皮質髓射線的近曲小管S3區上皮細胞中表達；而Scr在給藥7 d后才明顯升高[22]。本研究中，AKI組尿KIM-1指標在確診后2、4、8、12、24 h與非AKI組均有差異。尿 KIM-1 2 h水平預測 EHF合并AKI 的 ROC 曲線下面積為 0.785，截點值是0.55 pg/ml。

綜上所述，尿NGAL、KIM-1不受尿液理化性質的干擾，且為無創性檢查，因此，NGAL、KIM-1可能可以作為一種靈敏度和特異度較高的早期診斷EHF合并AKI的標志物。本次研究樣本量小，多個對尿NGAL、KIM-1存在影響的混雜因素沒有得到控制，所以其診斷價值還需要大規模、多中心和前瞻性的試驗提供足夠的證據支持。

作者貢獻：劉雷負責研究設計與實施、資料整理、撰寫論文、成文并對文章負責；徐璐負責數據采集、匯總及統計學分析；魏明明負責收集資料包括數據采集；王棟負責檢測尿NGAL和尿KIM-1指標；張宜明負責撰寫英文摘要；李新建負責修改論文。

本文無利益沖突。

[1]陳灝珠.實用內科學[M].12版.北京：人民衛生出版社，2005：383-384.

CHEN H Z.Practical internal medicine[M].12th ed.Beijing:People′s Medical Publishing House,2005:383-384.

[2]黎磊石，劉志紅.中國腎臟病學[M].北京：人民衛生出版社，2008：738-752.

LI L S,LIU Z H.Chinese nephrology[M].Beijing:People′s Medical Publishing House,2008:738-752.

[3]杜虹.重癥腎綜合征出血熱早期預警參數評估及預后風險模型的構建[D].西安：第四軍醫大學，2014：9-13.

DU H.Evaluation of early prediction factors and construction of risk models for the severity and prognosis in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome[D].Xi′an:The Fourth Military Medical University,2014:9-13.

[4]FERGUSON M A,VAIDYA V S,WAIKAR S S,et al.Urinary liver-type fatty acid-binding protein predicts adverse outcomes in acute kidney injury[J].Kidney International,2010,77(8):708-714.DOI:10.1038/ki.2009.422.

[5]HAN W K,WAIKARS S,JOHNSON A,et al.Urinary biomarkers in the early diagnosis of acute kidney injury[J].Kidney International,2008,73(7):863-869.DOI:10.1038/sj.ki.5002715.

[6]RONCO C,LEVIN A,WARNOCK D G,et al.Improving outcomes from acute kidney injury(AKI);Report on an initiative[J].International Journal of Artificial Organs,2007,30(5):373-376.

[7]LIU X Y,XUE K N,RONG R,et al.Fault tree analysis:investigation of epidemic hemorrhagic fever infection acquired in animal laboratories in China[J].Biomed Environ Sci,2016,29(9):690-695.DOI：10.3967/BES2016.093.

[8]FUCHS T C,HEWITT P.Biomarkers for drug-induced renal damage and nephrotoxicity——an overview for applied toxicology[J].Aaps Journal,2011,13(4):615-631.DOI:10.1208/s12248-011-9301-x.

[9]DOI K,YUEN P,EISNER C,et al.Reduced production of creatinine limits its use as marker of kidney injury in sepsis[J].Journal of the American Society of Nephrology,2009,20(6):1217-1221.DOI:11.1681/ASN.2008060617.

[10]GARDINER L,AKINTOAL A,Chen G,et al.Structural equation modeling highlights the potential of kim-1 as a biomarker for chronic kidney diseases[J].American Journal of Nephrology,2012,35(2):152-163.DOI:10.1159/000335579.

[11]SINHA V,VENCE L M,SALAHUDEEN A K.Urinary tubular protein-based biomarkers in the rodent model of cisplatin nephrotoxicity:a comparative analysis of serum creatinine,renal histology,and urinary kim-1,ngal,and nag in the initiation,maintenance,and recovery phases of acute kidney injury[J].J Investig Med,2013,61(3):564-568.DOI:10.2310/JIM.0b013e31828233a8.

[12]ZHAO C,OZAETA P,FISHPAUGH J,et al.Structural characterization of glycoproteinngal,an early predictive biomarker for acute kidney injury[J].Carbohydrate Research,2010,345(15):2252-2261.DOI:10.1016/j.carres.2010.07.024.

[13]ASSADI F,SHARBAF F G.Urine KIM-1 as a potential biomarker of acute renal injury after circulatory collapse in children[J].Pediatric Emergency Care,2016:1.DOI:10.1097/PEC.0000000000000886.

[14]MISHRA J,MA Q,PRADA A,et al.Identitication of neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury[J].Journal of the American Society of Nephrology Jasn,2003,14(10):2534-2543.DOI:10.1097/01.asn.0000088027.54400.c6.

[15]YAN J，HONG Y X,ZANG Z D,et al.Significance of early diagnosis of urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin and urinary interleukin-18 in patients with sepsis complicated with acute kidney injury[J].Journal of Soochow University Medical Science Edition,2011,31(5):785-788.

[16]MELNIKVO V Y,ECDER T,FANTUZZI G,et al.Impaired IL-18 processing protects caspase-1-deficient mice from ischemic acute renal failure[J].Journal of Clinical Investigation,2001,107(9):1145-1152.DOI:10.1172/JCI12089.

[17]HAN W K,BAILLY V,ABICHANDANI R,et al.Kidney Injury Molecule-1(KIM-1):a novel biomarker for human renal proximal tubule injury[J].Kidney International,2002,62(1):237-244.DOI:10.1046/j.1523-1755.2002.00433.x.

[18]ZHOU Y,VAIDVO V S,BROWN R P,et al.Comparison of kidney injury molecule-1 and other nephrotoxictity biomarkers in urine and kidney following acute exposure to gentamicin,mercury,and chromiums[J].Toxicological Sciences,2008,101(1):159-170.DOI:10.1093/toxsci/kfm260.

[19]GUO L,TAKINO T,ENDO Y,et al.Shedding of kidney injury molecule-1 by membrane-type 1 matrix metalloproteinase[J].Journal Biochemistry,2012,152(5):425-432.DOI:10.1093/jb/mvs082.

[20]KRAMER A B,TIMMEREN M M,SCHUURS T A,et al.Reductio of proteinuria in adriamycin-induced nephropathy is associated with reduction of renal kidney injury molecule(Kim-1)over time[J].American journal of physiology Renal physiology,2009,296(5):1136-1145.DOI:10.1152/ajprenal.00541.2007.

[21]HAN W K,WAIKAR S S,JOHNSON A,et al.Urinary biomarkers in the early diagnosis of acute kidney injury[J].Kidney International,2008,73(7):863-869.DOI:10.1038/sj.ki.5002715.

[22]LUO Q H,CHEN M L,CHEN Z L,et al.Evaluation of KIM-1 and NGAL as early indicators for assessment of gentamycin-induced nephrotoxicity in vivo and in vitro[J].Kidney & Blood Pressure Research,2016,41(6):911-918.DOI:10.1159/000452592.

ValueofUrineNeutrophilGelatinase-associatedLipocalinandKidneyInjuryMolecule-1forEarlyDiagnosisofAcuteKidneyInjuryinPatientswithEpidemicHemorrhagicFever

LIULei，XULu，WEIMing-ming，WANGDong，ZHANGYi-ming，LIXin-jian*

ObjectiveTo assess the value of urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL) and kidney injury molecule-1(KIM-1) for early diagnosis of acute kidney injury(AKI) in patients with epidemic hemorrhagic fever(EHF).MethodsThe enrolled participants were 41 cases of EHF who

treatment in Department of Nephrology,ICU,Department of Respiratory Medicine,or Department of Haematology,Affiliated Hospital of Jining Medical University from January 2014 to November 2016 and met the inclusion and exclusion criteria of this study.Based on the diagnostic standard of AKI,patients with AKI symptoms were assigned to the AKI group and the others were assigned to the non-AKI group.Levels of Scr,urine NGAL and KIM-1 were measured at the time of diagnosis,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h after diagnosis,respectively.The receiver operating characteristic(ROC) curve of urine NGAL and urine KIM-1 was used to evaluate their values for early diagnosis of AKI.ResultsAmong the 41 cases of EHF，26(63.4%) had concomitant AKI.At the time of diagnosis,the levels of Scr and urine KIM-1 were similar in both groups (P>0.05).Compared with the non-AKI group,AKI group had significantly increased Scr levels at 24 h,48 h,72 h after the diagnosis(P<0.05).The levels of urine NGAL varied significantly by the time of measurement in both groups(P<0.05).The levels of urine KIM-1 varied obviously by the time of measurement after diagnosis in both groups(P<0.05).Pearson′s correlation analysis found that,the level of Scr measured at 24 h after diagnosis was positively correlated with that of urine KIM-1 measured at 2 h after diagnosis (r=0.673,P<0.01),and it presented a linear positive correlation with the level of urine NGAL measured at 2 h after diagnosis(r=0.846,P<0.01 ).The AUC of ROC curve of level of urine NGAL measured at 2 h after diagnosis for the prediction of EHF with AKI was 0.822〔95%CI(0.692，0.952)〕 with a cutoff value of 40.15 pg/ml.For the prediction of EHF with AKI,the AUC of ROC curve of level of urine KIM-1 was 0.785〔95%CI(0.643，0.927)〕 with a cutoff value of 0.55 pg/ml.ConclusionUrine NGAL and KIM-1 may be used as the markers for early diagnosis of EHF with AKI.

Neutrophil gelatinase-associated lipocalin;Kidney injury molecule-1;Epidemic hemorrhagic fever;Acute kidney injury

濟寧市科技發展計劃項目(2014jnnk04)

272000 山東省濟寧市，濟寧醫學院附屬醫院

*通信作者：李新建，教授,主任醫師；E-mail:lixinjian8018@163.com

R 692

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.31.014

劉雷，徐璐，魏明明，等.尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白和腎損傷分子-1在流行性出血熱合并急性腎損傷早期診斷中的價值研究[J].中國全科醫學，2017，20(31)：3902-3906.[www.chinagp.net]

LIU L,XU L,WEI M M,et al.Value of urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin and kidney injury molecule-1 for early diagnosis of acute kidney injury in patients with epidemic hemorrhagic fever[J].Chinese General Practice，2017，20(31)：3902-3906.

AffiliatedHospitalofJiningMedicalUniversity,Jining272000,China

*Correspondingauthor:LIXin-jian,Professor,Chiefphysician；E-mail:lixinjian8018@163.com

2017-03-10；

2017-08-30)

(本文編輯：殷麗剛)