2株石油降解菌的分離鑒定

詹亞斌，馬立安，陶興玲 何山文，王鵬宇，鄧剛

長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025

江濤

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

2株石油降解菌的分離鑒定

詹亞斌，馬立安，陶興玲 何山文，王鵬宇，鄧剛

長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025

江濤

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

為了篩選高效石油降解菌株，通過富集馴化培養(yǎng)，從江漢油田石油污染土樣中篩選能以石油為唯一碳源生長的菌株。經(jīng)過劃線培養(yǎng)獲得單菌落，并通過形態(tài)觀察、生理生化及分子生物學(xué)分析對菌株進(jìn)行了初步鑒定和系統(tǒng)分類。結(jié)果分離獲得2株石油降解效率較高的菌(分別記為G-40和G-94)，初步鑒定G-40為側(cè)孢芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)，G-94為熱帶假絲酵母菌(Candidatropicalis)。

石油；降解菌；分離；鑒定

石油在開采、運(yùn)輸、加工、儲存過程中不可避免地會發(fā)生石油泄漏事故，造成土壤及水體的嚴(yán)重污染，直接或間接危害人類健康。石油污染日益嚴(yán)重，對其治理已經(jīng)刻不容緩[1]。

由于生物修復(fù)技術(shù)具有環(huán)境友好、成本低廉、操作簡單、對操作人員危害小、作用徹底等特點(diǎn)，越來越引起人們的重視，被廣泛應(yīng)用到環(huán)境污染治理領(lǐng)域[2～4]，成為一種替代化學(xué)和物理技術(shù)的修復(fù)石油污染土壤的新技術(shù)。

土壤中存在著許多可以利用有機(jī)物的微生物，主要有細(xì)菌、真菌、放線菌等，它們具有氧化分解有機(jī)物的能力。在許多條件下，降解菌馴化時間長、生長速度慢、代謝活性不高，并且很不穩(wěn)定，因此篩選一些穩(wěn)定高效降解污染物的菌種，是生物修復(fù)的必然要求[1]。

本課題組從江漢油田石油污染土壤中分離獲得石油降解單菌，為后期研究其石油降解特性做準(zhǔn)備，同時也為石油污染土壤生物修復(fù)提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1材料

石油污染土樣采自江漢油田作業(yè)油井及廢棄老井附近，離地表20～25cm的土壤，多點(diǎn)采樣后裝入無菌袋中密閉保存?zhèn)溆谩Ｋ性噭┚鶠榉治黾兓蚧瘜W(xué)純。

富集、馴化培養(yǎng)基制作方法參考文獻(xiàn)[5]，馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、細(xì)菌選擇性培養(yǎng)基、真菌選擇性培養(yǎng)基(馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基)制作方法參考文獻(xiàn)[6]。

1.2方法

1.2.1石油降解菌的富集、馴化與分離

稱取新鮮的石油污染土壤樣品約5g放入100mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，35℃、150r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)5d，將菌液按照5%的接種量重新轉(zhuǎn)接到新鮮的富集、馴化培養(yǎng)基中，以5d為1個周期，連續(xù)培養(yǎng)3個周期，獲得能以石油作為唯一碳源和能源的混合菌群[5]。

菌株純種分離：將混合菌群培養(yǎng)液稀釋涂布于細(xì)菌/真菌選擇性培養(yǎng)平板中，在35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取不同單菌落，在細(xì)菌/真菌選擇性培養(yǎng)基上多次劃線純化后，再挑選單菌落保種于牛肉膏蛋白胨/馬鈴薯蔗糖試管斜面中，同時采用終濃度20%滅菌甘油凍管法保存于-80℃條件下。

1.2.2石油降解率的測定

將分離純化獲得的細(xì)菌/真菌挑取一環(huán)，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基/馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，取生長在對數(shù)期的菌液，以5%(v/v)的接種量接入到石油培養(yǎng)基中，35℃、pH 7.0、150r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)30d，測定石油降解率。

采用重量法測定石油降解率。向含油三角瓶中分4次加入80mL二氯甲烷，萃取出石油，經(jīng)過無水硫酸鈉柱除水后，室溫晾干直至有機(jī)溶劑完全揮發(fā)。將石油放置真空干燥箱40℃，真空度0.04MPa下保持30min后，取出置于干燥器中30min，稱重，重復(fù)3次[5]。石油降解率按如下公式計算：石油降解率=[(空白石油烴濃度-培養(yǎng)液石油烴濃度)/空白石油烴濃度]×100%。

1.2.3菌體形態(tài)與培養(yǎng)特征的觀察

菌體染色后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。在牛肉膏蛋白胨/馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)平板上觀察菌落特征。

1.2.4生理生化性質(zhì)測定

按照文獻(xiàn)[6]的方法，對該菌株進(jìn)行生理生化性質(zhì)測定，分別包括：明膠液化試驗、吲哚試驗、過氧化氫酶試驗、檸檬酸鹽試驗、甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇試驗(V.P.)、淀粉水解試驗、油脂水解試驗、產(chǎn)氨試驗、硝酸鹽還原試驗、苯丙氨酸脫氫酶試驗、產(chǎn)硫化氫試驗。重復(fù)3次，每次做3組，記錄結(jié)果。

1.2.5分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌總DNA提取采用煮沸法[7]，真菌總DNA的提取采用CTAB法[8]。

以提取到的細(xì)菌DNA為模板，采用通用引物擴(kuò)增16S rDNA，上游引物27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，擴(kuò)增反應(yīng)于Bio-Rad PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為25μL，其體系為 2×PCR 12.5μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL，DNA模板2μL，雙蒸水8.5μL。PCR 擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min 30s，30個循環(huán)；72℃終延伸10min。

以提取得到的真菌DNA為模板，采用通用引物擴(kuò)增ITS rDNA，上游引物ITS 5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，下游引物ITS 4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；擴(kuò)增反應(yīng)于Bio-Rad PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為25μL，其體系為 2×PCR 12.5μL，ITS 5(10μmol/L)1μL，ITS 4(10μmol/L)1μL，DNA模板2μL，雙蒸水8.5μL。PCR 擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；72℃終延伸7min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物和Mark上樣量均為5μL，電泳結(jié)果于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像。PCR產(chǎn)物經(jīng)AxyPrep PCR清潔試劑盒純化；純化后的PCR產(chǎn)物送生工生物(武漢)股份有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析，并通過軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

圖1 2株菌株的石油降解率

2.1菌株分離結(jié)果

從污染土壤中分離獲得2株石油降解單菌，分別記為G-40和G-94。

2.2分離菌株的石油降解率

從圖1可以看出，G-40和G-94在35℃、pH7.0、油濃度2%、鹽濃度0.5%、150r/min的條件下，石油降解率分別為21.59%和37.03%，兩者之間具有顯著差異(P<0.05)。

2.3菌體形態(tài)與培養(yǎng)特征

將2株菌分離培養(yǎng)后(G-40培養(yǎng)2d，G-94培養(yǎng)8d)，G-40和G-94的菌落形態(tài)分別見圖2和圖3，菌落特征見表1。

圖2 G-40菌落和菌體(1000×) 圖3 G-94菌落和菌體(1000×)

菌編號菌落形態(tài)顏色質(zhì)地突起 邊緣直徑/mm面積/mm2G?40圓形米黃色光滑凸透鏡狀完整201313G?94圓形乳白色光滑臍突狀完整155018521

表2 2株菌株的生理生化試驗結(jié)果

注：-代表陰性；+代表陽性。

2.4生理生化性質(zhì)測定

分離獲得的2株菌生理生化試驗結(jié)果如表2。

2.5分子生物學(xué)鑒定

對降解菌株G-40的16S rDNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終獲得長度約為1500bp的基因序列；對G-94的ITS rDNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終獲得長度約為750bp的基因序列。將其與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，G-40與Brevibacilluslaterosporus的序列相似度達(dá)到99%，G-94與Candidatropicalis的序列相似度達(dá)到99%。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行2株菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析如圖4和圖5所示。

圖4 G-40菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 G-94菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

從石油污染土壤中篩選獲得2株菌，經(jīng)菌落、菌體形態(tài)觀察、生理生化檢測及分子生物學(xué)進(jìn)行初步鑒定，確定G-40為側(cè)孢芽孢桿菌，G-94為熱帶假絲酵母菌。

G-40和G-94在35℃、pH7.0、油濃度2%、鹽濃度0.5%、150r/min的條件下石油降解率分別為21.59%和37.03%，兩者之間具有顯著性差異。

[1]詹亞斌，馬立安.生物修復(fù)石油污染土壤研究進(jìn)展[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版)，2016，13(33)：52～56.

[2] 涂書新，韋朝陽.我國生物修復(fù)技術(shù)的現(xiàn)狀與展望[J].地理科學(xué)進(jìn)展，2004，23(6)：20～23.

[3] 范俊，沈樹寶，楊維本，等.高效符合生態(tài)鏈微生物菌群處理污水的研究：城市綜合污水的處理[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2003，25(4)：10～13.

[4] 陳曉，王丹丹，李棟蕓，等.生物絮凝劑產(chǎn)生菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化及其應(yīng)用[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，31(2)：20～24.

[5] 詹亞斌，張橋，陳凱倫，等.石油降解菌群的篩選、構(gòu)建及其降解特性研究[J].環(huán)境污染與防治，2017，39(8)：860～864，868.

[6] 趙斌，何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[7] 姜曉宇.綠肥輪作水稻種子內(nèi)生菌多樣性及土壤微生物數(shù)量研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[8] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucl Acid Res, 1980, 8: 4321～4326.

2017-06-23

詹亞斌(1991-)，男，碩士生，研究方向為環(huán)境微生物。通信作者：江濤，jiangtao@yangtzeu.edu.cn。

[引著格式]詹亞斌，馬立安，陶興玲，等.2株石油降解菌的分離鑒定[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版)，2017,14(18)：61～64.

TE991;Q939.99

A

1673-1409(2017)18-0061-04

[編輯] 余文斌