響應面曲線法優化豆葆茶飲用沖泡條件及其抗氧化能力研究

陶阿麗,尹偉,施苗苗,孟博

(安徽新華學院藥學院，安徽 合肥 230088)

響應面曲線法優化豆葆茶飲用沖泡條件及其抗氧化能力研究

陶阿麗,尹偉,施苗苗,孟博

(安徽新華學院藥學院，安徽 合肥 230088)

以綠原酸的提取率為指標，采用響應面曲線法對古方豆葆茶的飲用沖泡條件進行了優化，并對其抗氧化能力進行了研究。在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken實驗分別分析各因素之間的交互作用和顯著性，以獲得豆葆茶最佳飲用沖泡工藝。結果顯示，豆葆茶最佳飲用沖泡條件是：沖泡時間20min，加水量23mL/g，沖泡溫度90℃，該條件下豆葆茶有效活性成分綠原酸的提取率達到最大，為2.219%。豆葆茶水提物對羥基自由基和超氧陰離子的清除率測定結果顯示其具良好的體外抗氧化活性。

豆葆茶；綠原酸；沖泡；響應面曲線法；抗氧化

豆葆茶主要由金銀花、薄荷以及蒲公英3種天然草本為主要原料配制而成的古方茶飲，在中國古老茶療文化中占有很重要的作用，具有清心、明目、抗炎、消腫等作用。綠原酸(Chlorogenic acid，CGA)富含于金銀花、蒲公英中，是豆葆茶重要的生物活性成分。綠原酸又名咖啡鞣酸，是咖啡酸與奎尼酸的縮酚酸[1]，其主要的功效有抗菌[2]、抗病毒[3,4]、抗癌[5]、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤[6～9]和降血壓并保護心血管的作用。為了充分發揮豆葆茶的茶療作用，對豆葆茶飲用沖泡條件進行研究具有重要意義。本研究采用響應面曲線法設計試驗，以綠原酸提取率為指標，確定古方豆葆茶的最佳飲用沖泡條件。通過考察豆葆茶水提物對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率，獲得豆葆茶水提物的體外抗氧化活性，以期為古方豆葆茶的研究及開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

豆葆茶為金銀花、薄荷、蒲公英按1∶1∶1比例組方，均購于安徽省合肥市安天大藥房，經安徽中醫藥大學劉金旗副教授鑒定；綠原酸對照品購于中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心；FeSO4、水楊酸等試劑均為分析純。

UV-4802S 型紫外可見分光光度儀為尤尼柯(上海) )儀器有限公司產品；DZF-6020 型真空干燥箱為上海三發科學儀器有限公司產品；HH數顯恒溫水浴鍋為江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠產品；FA2004 型電子天平為上海民橋精密科學儀器有限公司產品。

1.2方法

1.2.1綠原酸標準曲線繪制

圖1 綠原酸標準曲線

精密稱定綠原酸對照品0.0036g，于100mL容量瓶中用蒸餾水定容，即得濃度為36μg/mL的綠原酸標準溶液。分別吸取一定量標準溶液置于10mL容量瓶中定容至刻度，獲得0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μg /mL的待測溶液[10]。在波長326nm處測定各濃度溶液的光密度。以溶液濃度C為橫坐標、光密度D為縱坐標繪制標準曲線(圖1)，得回歸方程為D=0.0460C-0.0845，R2=0.9977。

1.2.2豆葆茶綠原酸的提取及含量測定

稱取豆葆茶1g，置于100mL燒杯中，加入一定量的蒸餾水，在一定溫度下水浴加熱一定的時間，抽濾得綠原酸提取液，濾液稀釋一定比例后在波長326nm處測得光密度[11]，根據回歸方程換算綠原酸提取的濃度，進而計算其提取率。

式中：Y為綠原酸提取濃度，mg/mL；V為反應體積，mL；M為提取物的質量，g。

1.2.3試驗設計

根據預試驗結果，以豆葆茶中綠原酸的提取率為指標，分別選擇沖泡時間、加水量和沖泡溫度為影響因素進行單因素試驗。再根據單因素試驗的結果，應用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計，選取沖泡時間(A)、加水量(B)、沖泡溫度(C)為考察因素，各因素設置3水平。根據響應面試驗結果，確定豆葆茶最佳飲用沖泡條件。

1.2.4豆葆茶水提物抗氧化試驗

1)羥基自由基清除試驗 采用Fenton反應[11]，將6mmol/L FeSO4溶液2.0mL和6mmol/L 水楊酸溶液2.0mL混合，再加入不同濃度的豆葆茶水提取液和維生素C各2.00mL，最后加入6mmol/L的H2O2溶液2mL，啟動反應，隨后靜置10min。以相同體積蒸餾水代替H2O2為空白對照，在波長510nm處測定光密度。每個樣品進行 3 次平行試驗，結果取平均值。根據以下公式計算其清除率：

式中：D0為空白管光密度；Di為樣品管光密度。

2)超氧陰離子清除試驗 根據鄰苯三酚法[12]稍加改進。取濃度為0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH8.2)4.5mL，在20℃水浴中加熱20min后，分別加入不同濃度的豆葆茶水提取液1.0mL和濃度為25mmol/L鄰苯三酚溶液0.4mL，搖勻，在25℃水浴中反應5min。隨后，加入8mol/L的鹽酸溶液1mL，終止反應。在波長299nm處測定溶液光密度。根據以下公式計算其清除率：

式中：D0為空白管光密度；Di為樣品管光密度。

2 結果與分析

2.1沖泡時間對豆葆茶綠原酸提取率的影響

稱取5份各1g的豆葆茶，分別加入蒸餾水15mL，在50℃水浴加熱5、10、15、20、25min，抽濾得綠原酸提取液，取1mL稀釋100倍，在326nm波長處測定光密度并計算提取率。由圖2可知，隨著沖泡時間的增加，綠原酸提取率不斷增加，到15min左右到達最大值，隨后提取率不再增大。因此，在其他條件確定時，最佳沖泡時間為15min。

2.2加水量對豆葆茶綠原酸提取率的影響

圖2 不同沖泡時間的綠原酸提取率

稱取5份各1g的豆葆茶，分別加入蒸餾水10、15、20、25、30mL，在50℃水浴加熱15min，抽濾得綠原酸提取液，取1mL稀釋100倍，在326nm波長處測5份不同濃度綠原酸提取液的光密度，根據標準曲線回歸方程計算綠原酸提取率。由圖3可知，加水量達到20mL左右時達最大綠原酸提取率。隨著加水量的增加，綠原酸提取率稍減少，但變化不明顯。因此，豆葆茶沖泡時的最佳加水量為20mL左右。

2.3沖泡溫度對豆葆茶綠原酸提取率的影響

稱取5份各1g的豆葆茶，分別加入蒸餾水20mL，分別在50、60、70、80、90℃水浴加熱15min，抽濾得綠原酸提取液，取1mL稀釋100倍，在326nm波長處測5份提取液的光密度，根據標準曲線計算提取率。由圖4可知，隨著沖泡溫度的升高，綠原酸提取率在不斷增加，當達到80℃有最大的提取率，之后隨沖泡溫度的升高，綠原酸的提取率下降。因此，在其他條件確定時，豆葆茶的最佳沖泡溫度是80℃。

圖3 不同加水量的綠原酸提取率 圖4 不同沖泡溫度的綠原酸提取率

2.4響應面法優化豆葆茶飲用沖泡條件

根據單因素試驗結果，選擇沖泡時間、加水量、沖泡溫度為影響因素，利用Design-Expert8.0.6軟件，根據Box-Behnken中心組合設計試驗[13]，因素水平設計詳見表1，響應面試驗設計及結果見表2。對試驗所得的數據進行多次擬合，得到豆葆茶綠原酸提取率方程為：

Y=2.16-0.01A+0.14B+0.053C+0.027AB+0.048AC-0.012BC-0.022A2-0.14B2-0.047C2

式中：Y為提取率；A為沖泡時間；B為加水量；C為沖泡溫度。

表1 因素水平

表2 Box-Behnken設計及綠原酸提取試驗結果

回歸方程顯著性檢驗及方差分析結果見表3。

表3 模型與方差

圖5 沖泡時間和加水量對提取率的影響

應用響應面分析法對試驗結果和數學模型進行分析，結果顯示，回歸模型呈現出高度顯著(P<0.0001)，失擬項不顯著(P=0.6276>0.05)，可知回歸方程的擬合度和可信度均較高，能夠很好預測各條件下豆葆茶中綠原酸的提取率。

通過響應面圖(圖5、圖6、圖7)，可以直觀地觀察各影響因素之間的相互關系。由圖5所示，當加水量達到23mL左右、沖泡時間20min左右，綠原酸的提取率達到最大值。由圖6所示，當提取時間為20min左右、溫度89℃左右提取率達到最大值，之后在最大值附近波動。由圖7所示，出當加水量達到23mL左右和溫度為89℃左右時，綠原酸的提取率達到最大值。對擬合方程進行優化，即得模型最大值，即沖泡時間為20.00min、加水量為22.69mL、沖泡溫度為89.96℃。在該工藝條件下，預測綠原酸的最大提取率可達2.219%。考慮到實際操作的可行性，需對二次回歸所得到的最佳條件修正擬合。最后，確定最佳沖泡條件為：沖泡時間為20min、加水量為23mL、沖泡溫度為90℃。為了驗證該提取工藝的可行性，重復最佳沖泡條件3次，獲得綠原酸提取率的平均值為2.25%。結果與二項式擬合方程預測的最大值進行比較，平均偏差為1.40%，顯示該模型有效。

2.5不同濃度豆葆茶水提物對·OH的清除能力

不同濃度豆葆茶水提物對·OH的清除率試驗結果如圖8所示。結果顯示，豆葆茶水提物對·OH的清除能力強于相同濃度的維生素C(P<0.05)。同時隨著濃度的增加，豆葆茶水提物對·OH的清除能力逐步增強。

圖6 沖泡時間和沖泡溫度對提取率的影響圖7 加水量和沖泡溫度對提取率的影響

2.6不同濃度豆葆茶水提物對超氧陰離子的清除能力

圖8 不同濃度豆葆茶水提物對·OH的清除率 圖9 不同濃度豆葆茶水提物對O-2·的清除率

3 結論

在單因素試驗基礎上，采用響應曲線法進行試驗設計，以豆葆茶中綠原酸提取率為響應指標，優選出豆葆茶的最佳沖泡工藝。同時，采用羥基自由基、超氧陰離子2種體外抗氧化模型，考察了豆葆茶提取物的體外抗氧化能力。單因素試驗結果顯示，沖泡時間、加水量、沖泡溫度對綠原酸的提取率均有影響。采用響應面曲線法優選豆葆茶的最佳沖泡飲用工藝條件，結果顯示，豆葆茶的最佳沖泡飲用條件為:沖泡時間為20min，加水量為23mL/g，沖泡溫度為90℃。在此最佳沖泡條件下，豆葆茶中綠原酸的提取率的最大值為2.25%。因此，在飲用豆葆茶時，需要在90℃熱水中按1︰23的比例浸泡約20min，此時綠原酸的提取率達到最大，使豆葆茶清熱解毒藥用效果最好。同時，豆葆茶的水提取物對羥基自由基、超氧陰離子均具較明顯的清除作用，羥基自由基清除率強于維生素C，超氧陰離子清除率弱于維生素C，但都與其濃度存在著明顯的量效關系。

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2017-04-07

安徽省教育廳高校優秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016395)；安徽省教育廳質量工程項目(2016mooc194)；國家級大學生創新訓練項目(201612216011)；安徽省大學生創新訓練項目(201612216091)；安徽新華學院校級科研團隊項目(2016td016)。

陶阿麗(1983-)，女，副教授，主要從事基礎化學與天然產物開發研究，taoali84 @163.com。

[引著格式]陶阿麗,尹偉,施苗苗,等.響應面曲線法優化豆葆茶飲用沖泡條件及其抗氧化能力研究J.長江大學學報(自科版) ，2017，14(18)：65～70.

TS272.5

A

1673-1409(2017)18-0065-06

[編輯] 余文斌