國標試管法與試劑盒微孔法檢測嬰幼兒奶粉中葉酸含量的結果比較

嚴 燁，鄒 力，舒 靜，王 瑛，唐 欣，樊 成

（1. 西安悟空檢測科技有限公司，陜西西安 710065；2. 陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安 710048）

國標試管法與試劑盒微孔法檢測嬰幼兒奶粉中葉酸含量的結果比較

嚴 燁1，鄒 力2，舒 靜2，王 瑛2，唐 欣1，樊 成2

（1. 西安悟空檢測科技有限公司，陜西西安 710065；2. 陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安 710048）

采用國標試管法GB 5413.16和微孔板形式的微生物法，定量檢測6罐嬰幼兒配方羊奶粉中的葉酸含量。國標試管法檢測YNF1-1，YNF1-2，YNF2-1，YNF2-2，YNF3-1及YNF3-2的葉酸結果分別為118.5，112.3，105.9，97.5，89.5，97.6 μg/100 g；試劑盒微孔法檢測6個樣品的葉酸含量分別為129.9，125.8，101.4，102.3，99.0，100.4 μg/100 g。結果表明，同一產品不同個體之間的葉酸含量存在差異，國標試管法的穩定性低于試劑盒微孔法?？稍谝欢〞r間內用試劑盒微孔法對國標試管法進行驗證和偏差值評定，確保檢測結果真實反映樣品中葉酸含量。

GB 5413.16；微孔板；葉酸

（1. Xi'an Wukong Testing Technology Co.， Ltd.， Xi'an， Shaanxi 710065， China；2. Shaanxi Product Quality Supervision and Inspection Research Institute，Xi'an，Shaanxi 710048，China）

葉酸（Folic acid），即通常所說的VB9，是微生物B復合體之一，是嬰幼兒乳粉中規定添加的營養成分[1-3]。葉酸具有促進骨髓中幼細胞成熟的作用，人體缺乏葉酸可引起巨紅細胞性貧血癥或白細胞減少癥[4]、腦卒中[5]、血管性癡呆[6]等。所以，對于嬰幼兒奶粉中葉酸含量的檢測監測非常重要。

葉酸的測定方法有間接熒光定量法[7-8]、高效液相色譜法[9-10]、微生物濁度法[11-12]、差示脈沖溶出法[13]。國家標準參考微生物濁度法進行制定，原理是利用干酪乳桿菌 （Lactobacillus casei） ATCC 7469 對葉酸的特異性，通過其在含有葉酸的樣品中生長產生形成的光密度來測定葉酸含量[14]。葉酸檢測試劑盒同樣利用微生物方法，將樣品提取液和葉酸檢測用培養基加入包被有鼠李糖桿菌（Lactobacillus rhamnosus）的微孔板中，該菌的生長情況取決于葉酸的含量。

采用2種不同的微生物方法對6罐某品牌嬰幼兒配方羊奶粉中葉酸含量檢測，對比2種方法的差異性。

1 材料與方法

市場市售嬰幼兒配方羊奶粉，某品牌金裝嬰兒配方羊奶粉、金裝較大嬰兒配方羊奶粉及金裝幼兒配方羊奶粉，每種各購買2罐，分別編號為YNF1-1， YNF1-2， YNF2-1， YNF2-2， YNF3-1， YNF3-2。

SPX-80SH-Ⅱ型生化培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司產品；SM800型酶標儀，上海永創醫療器械有限公司產品。

乳酸桿菌肉湯培養基（生化級，批號1610171）、乳酸桿菌瓊脂培養基（生化級，批號1611161），購自北京陸橋技術股份有限公司；葉酸檢測培養基（生化級，批號：4020410），購自美國BD醫療器械有限公司；干酪乳桿菌（生化級，批號233-25-1），購自美國ATCC標準菌株保存庫；葉酸標準品（分析純，批號：30717），購自德國Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司；葉酸檢測試劑盒（生化級，批號KF42724），購自德國拜發R-Biopharm公司。

1.3.1 國標試管法[13]

（1） 樣品待測液制備。稱取2.000 g左右樣品置于50 mL燒杯中，加入20 mL蒸餾水復溶，轉移定容至100 mL容量瓶中，量取5 mL定容至250 mL容量瓶中，加水定容，再從250 mL容量瓶中吸取10 mL溶液加入100 mL容量瓶中，用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（稱取5.85 g磷酸二氫鉀，1.22 g磷酸氫二鉀，用1 000 mL水溶解；使用前按0.5 g/100 mL 加入抗壞血酸）定容，即為樣品待測液，稀釋倍數為50 000。

（2） 接種菌懸液制備。標準菌株活化后保藏于乳酸桿菌瓊脂斜面上備用；試管用活性洗潔劑清洗干凈，烘干，分裝10 mL乳酸桿菌肉湯培養基，于121 ℃條件下滅菌15 min；冷卻后接種干酪乳桿菌，于36±1 ℃條件下培養18 h，然后將菌懸液移至無菌離心管中，以轉速4 000 r/min離心5 min，傾倒上清液，加入10 mL 0.85%滅菌生理鹽水，振蕩混勻，再以轉速4 000 r/min離心5 min，傾倒上清液，重復清洗菌體3次后，加入10 mL 滅菌生理鹽水復懸菌體。吸取1 mL菌懸液加入10 mL滅菌生理鹽水中混勻，調整透光率至60%～80%，即為接種菌懸液。

（3） 葉酸標準工作液最終質量濃度為0.05 ng/mL及0.1 ng/mL。葉酸檢測用培養基制備按照標簽說明配制備用。

（4） 檢測管制備。采用9個梯度，3個平行。按國標試管法中順序加入蒸餾水、標準工作液和葉酸測定用培養基于培養管中。試管S2～S10中，相當于葉酸含量為 0， 0.05， 0.10， 0.15， 0.20， 0.25， 0.30，0.40，0.50 ng/100 g。按試劑盒微孔法中順序在測定用培養基試管中加入蒸餾水、試樣和葉酸。

（5） 滅菌。將標準曲線管和試樣管于121 ℃條件下滅菌5 min，迅速冷卻到室溫。

（6） 接種。無菌條件下每管中均加入1滴（約50 μL） 接種菌懸液，加蓋，充分振蕩混勻所有試管（標準曲線未接種空白管S1除外）。

（7） 培養。在36±1 ℃條件下培養16～24 h。對每支試管進行目測檢查，未接種管內培養液應是澄清的，標準曲線管和試樣管中培養液的濁度應有梯度。

（8） 測定。以接種空白管（國標試管法中試管號S2） 作對照，取出最高濃度標準曲線管S7，振蕩5 s，于波長550 nm處讀取光密度，放回重新培養。2 h 后同等條件重新測該管的光密度，如果2次光密度的絕對差結果≤2%，則取出全部檢驗管測定標準溶液和試樣的光密度。

（9） 以標準曲線管葉酸含量作橫坐標、光密度為縱坐標，繪制標準曲線[15]。用樣品吸光度查圖得到數值，按照公式進行計算。

式中：X——樣品中葉酸含量，μg/100 g；

Cx——樣品4個梯度總平均值，ng；

f——稀釋倍數，50 000；

m——稱樣量。

1.3.2 試劑盒微孔法

（1） 樣品待測液制備。秤取1.000 g左右樣品置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL左右磷酸鹽緩沖液（7.8 g 磷酸二氫鈉和1 g 抗壞血酸鈉溶解于1 L蒸餾水中，校正pH值至7.2；每天新配緩沖液） 復溶混勻，再添加磷酸鹽緩沖液至40 mL刻度。蓋塞后于95 ℃水浴中保存30 min，期間振蕩3次；迅速冷卻后以轉速8 000 r/min離心5 min；吸取上清液在1.5 mL離心管中梯度稀釋至300倍。

（2） 培養基制備。將10 mL無菌水和1 mL試劑盒中緩沖液加入自帶培養基瓶中，渦旋振蕩混勻，置于95 mL水浴中保溫5 min；迅速冷卻，過0.22 μm無菌膜備用。

（3） 標準溶液制備。用自帶標準溶液配制6個梯度， 即 0， 160， 320， 640， 960， 1 280 ng/100 g。

（4） 加樣。按照需要取適量孔板，移取150 μL葉酸培養基至微孔中，移取150 μL標準品或稀釋樣品至指定的微孔中，用黏合箔蓋住板條或微孔（除去黏合箔上的保護層，將其平放在微孔條上，用手將黏合箔平壓，使其充分封閉微孔板條）。

（5） 培養。在37±1 ℃黑暗條件下孵育48 h。（6） 測量。用酶標儀于波長550 nm處讀取吸光度。

（7） 以標準曲線管葉酸含量作橫坐標、光密度為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結果分析

國標試管法標準曲線結果見表1，國標試管法標準曲線見圖1。

由表1可知，國標試管法測得吸光度逐漸增大，同時標準差隨著葉酸含量的增大而增加，說明隨著菌體的不斷增加，培養液中營養成分變化更加明顯，導致細胞數量差異性增大。同時也發現，在培養時間相對較長（24 h） 的情況下，S10試管中吸光度也不斷增加，不能滿足≤2%的情況。

表1 國標試管法標準曲線結果

圖1 國標試管法標準曲線

由圖1可知，標準曲線的增長趨勢符合微生物生長曲線趨勢，包含對數增長期和穩定期，說明國標試管法可以滿足測定樣品中葉酸含量的要求。在曲線處理方面采取了手繪曲線的方式，同時在大量的檢測試驗過程中發現，在曲線點分散比較均勻的條件下，可以采用Origin等數據處理軟件擬合多元曲線，進行單變量求解，便于計算最終的結果。一般情況下，不能擬合一次曲線，防止產生較大的誤差。

試劑盒微孔法標準曲線結果見表2，試劑盒微孔法標準曲線見圖2。

表2 試劑盒微孔法標準曲線結果

由表2可知，試劑盒微孔法吸光度增加趨勢明顯，測定標準曲線吸光度的標準偏差保持在1%左右。同一批次試劑盒，培養時間固定，重現性良好。

由圖2可知，標準曲線的Origin擬合結果符合微生物生長曲線，對數期明顯。

國標試管法和試劑盒微孔法測定結果見表3。

圖2 試劑盒微孔法標準曲線

表3 國標試管法和試劑盒微孔法測定結果

由表3可知，國標試管法測得結果各梯度之間呈增加趨勢，各平行之間偏離度較微孔法測量結果大，21組數據標準差大于1%、3組數據大于2%，這是由于大體積菌液增長的不穩定性造成的。微孔法各樣品測定值之間偏差較小，標準差均小于1%。說明試劑盒微孔法的穩定性強于國標法。

國標試管法和試劑盒微孔法計算結果比較見表4。

表4 國標試管法和試劑盒微孔法計算結果比較/ μg·（100 g）-1

由表4可知，國標試管法檢測結果和試劑盒微孔法檢測結果之間存在差異，3組對比標準差大于5%，小于10%，說明2種方法在一定條件下是可以相互驗證的。同時發現，同一樣品不同個體之間的葉酸含量存在差異，說明葉酸在樣品中的分布不均勻。

3 結論

采用國標試管法和試劑盒微孔法分別對6罐嬰幼兒配方羊奶粉中的葉酸含量進行檢測，其中標準曲線趨勢相近，符合一般微生物生長曲線趨勢；國標試管法檢測結果各吸光度梯度平行間偏差大于試劑盒微孔法檢測結果間偏差，國標試管法的穩定性弱于試劑盒微孔法；國標試管法檢測所得葉酸含量同試劑盒微孔法檢測所得值有差異，但在允許范圍內；同一樣品不同個體之間的葉酸含量存在差異，表明葉酸在樣品中的分布存在不均勻性。說明在試劑盒微孔法原理同國標試管法原理相同的條件下，試劑盒微孔法的穩定性和重現性強于國標試管法。因此可在規定時間間隔內采用試劑盒微孔法對國標試管法進行驗證，評判檢測結果偏差值，確保測得葉酸含量結果能準確反映樣品中葉酸實際含量。

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TS252.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.016

1671-9646（2017） 10a-0054-04

2017-08-25

嚴 燁（1986— ），男，碩士，工程師，研究方向為微生物檢驗。