超聲微創外科技術加速鼠正畸牙移動過程中microRNA以及組織蛋白酶K的表達

李巖　姚燕

【摘要】 目的：探討在超聲微創外科技術加速大鼠牙移動過程中組織蛋白酶K以及相關microRNA的表達改變。方法：將2月齡Wistar雄性大鼠60只按照隨機分為空白對照組（對照組）、常規正畸治療組（正畸組）和超聲微創外科手術聯合正畸治療組（微創組）三組，每組20只。在正畸組中，大鼠上頜左側第一磨牙與上切牙之間安裝正畸裝置，將磨牙以力值30 g的力量拉向近中移動；而微創組則為在正畸治療的同時，在第一磨牙的近遠中用超聲骨刀切開骨皮質至骨髓質。每組于建立模型加力7 d時將大鼠處死，通過HE染色觀察牙周組織的形態學變化并計數壓力側破骨細胞數目；通過Western blot檢測牙周組織中組織蛋白酶K的表達改變；并通過實時定量PCR（Quantitative real time PCR，qRT-PCR）檢測牙周組織中維持高表達的microRNA（miR-17，miR-21，miR-126，miR-32，miR-147，miR-155）的表達改變。結果：HE染色結果顯示，與對照組相比，正畸組中牙周組織的形態發生明顯病理學變化，并且大鼠壓力側破骨細胞數量明顯高于對照組（P<0.05）。此外，正畸組中組織蛋白酶K的表達也出現明顯上調，并伴隨有牙周組織中miR-17、miR-21、miR-126、miR-32、miR-147、miR-155的表達紊亂（P<0.05）。但是在微創組中，牙周組織的形態、大鼠壓力側破骨細胞數量、組織蛋白酶K的表達及microRNA的表達紊亂均得到了改善（P<0.05）。結論：超聲微創外科技術創傷小，術后腫痛輕，對牙周組織的影響小，能夠加速正畸牙移動，適用于臨床正畸治療。

【關鍵詞】 超聲微創外科技術； 正畸治療； 組織蛋白酶K； MicroRNA

Expression of MicroRNA and Cathepsin K in the Process of Accelerating Orthodontic Tooth Movement Through Ultrasonic Minimally Invasive Surgical Techniques in Rats/LI Yan，YAO Yan.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：016-020

【Abstract】 Objective：To explore the expression of cathepsin K and relevant microRNA in the process of accelerating orthodontic tooth movement through ultrasonic minimally invasive surgical techniques in rats.Method：A total of 60 Wistar male 2-month-old rats were divided into normal control group（the control group），orthodontic device group（the orthodontic group） and ultrasonic minimally invasive surgical techniques combined orthodontic treatment group（the minimally invasive group） according to random number table method，20 cases in each group.In the orthodontic group，the rats were installed orthodontic device between the left maxillary first molars and incisors，molars were pulled to the middle with the power of the force value 30 g.The minimally invasive group and the orthodontic group at the same operation，the cortical bone was penetrated to a depth of 0.5 mm mesially and distally in the first molar.The rats of each group were killedon the seventh day.The morphological changes of periodontal tissuewere observedvia HE staining and osteoclast number of the pressure side was counted.The expression of cathepsin K change of periodontal tissue was detected by Western blot and expression changes of high expression microRNA in periodontal tissue were detected through real-time Quantitative PCR，such as miR-17，miR-21，miR-126，miR-32，miR-147，miR-155.Result：Compared with the control group，HE staining results showed that periodontal tissue morphogenesis of the orthodontic group had obvious pathology change，and the osteoclast number of the pressure side was significantly higher than that of the control group（P<0.05）.In addition，the orthodontic group also showed obviously up-regulated the expression of cathepsin K，and was accompanied by expression turbulence of miR-17，miR-21，miR-126，miR-32，miR-147，miR-155 in the periodontal tissue（P<0.05）.While in the minimally invasive group，the configuration of periodontal tissue，osteoclast number of pressure side，the expression of cathepsin K and microRNA expression disorders were improved（P<0.05）.Conclusion：Compared with conventional orthodontic method，ultrasonic minimally invasive surgical techniques wound is small，light postoperative sore，small impact on periodontal tissue，it can accelerate orthodontic tooth movement，so it may be suitable for clinical orthodontic treatment on the teeth.endprint

【Key words】 Ultrasound minimally invasive surgical techniques； Orthodontic treatment； Cathepsin K；MicroRNA

First-authors address：Liaocheng Peoples Hospital，Liaocheng 252000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.005

口腔正畸治療中牙齒的移動是一個牙周組織改建的過程，其受激素、生長因子、系統因素好的機械力等多種因素影響，是一個非常復雜的過程，其具體的分子生物學機制仍不清楚。并且如何加速正畸牙齒的移動，縮短治療過程和保持正畸治療后牙齒的穩定而理想的位置是治療的關注重點。目前，超聲微創外科技術治療成為研究熱點，該技術具有能夠軟硬組織識別、創傷小、恢復快等優點，能夠有效的保護牙周膜細胞。

組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）主要存在于破骨細胞中，是一種半胱氨酸蛋白酶，其作用主要表現為降解骨連接素、膠原纖維等多種骨基質蛋白[1-2]。目前研究表明CTSK在破骨細胞中呈現高表達，與NF-κB受體活化劑配體，活化T細胞核因子，線粒體翻譯起始因子等信號通路相互作用，增強破骨細胞形成和骨吸收[3-4]。此外，microRNA的研究是當前生物科學領域研究的熱點之一，筆者選擇牙周組織中高表達的六個microRNA、miR-17、miR-21、miR-126、miR-32、miR-147、miR-155等為研究對象，檢測正畸治療過程中牙周組織中microRNA的表達改變情況。

本文觀察超聲微創外科手術加速大鼠正畸牙移動以縮短治療過程，并檢測牙移動過程中組織蛋白酶K以及microRNA表達的改變，旨在探討超聲微創外科手術對牙周組織改建的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立 選取60只2月齡SPF級的Wistar雄性大鼠，體重200～220 g/只，并且通過口腔檢測觀察大鼠均牙列完整。大鼠均行10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠仰臥固定。選取左側上頜為實驗側，以左上切牙為支抗，拉第一磨牙近中移動。使用牙科專用高速渦輪車針處理大鼠雙側上頜切牙，在其第一磨牙齦緣處構建固位溝，并同時準備0.25 mm的正畸專用不銹鋼結扎絲，上頜切牙與第一磨牙之間將螺旋彈簧結扎，在第一磨牙的近遠中用超聲骨刀切開骨皮質至骨髓質，牽引左側上頜第一磨牙向近中移動，力約30 g，持續7 d。

1.2 HE染色 于第7天時處死大鼠，解剖上頜骨并取得上頜第一磨牙以及牙周組織作為標本，用4%的多聚甲醛溶液固定24 h，再用pH值為7.4的10%EDTA溶液脫鈣50 d，用流水洗凈脫鈣液后使用不同濃度的乙醇溶液進行梯度脫水，再用二甲苯溶液進行組織的透明處理，最后使用石蠟包埋，送往醫院病理科進行組織塊的切片。對所得樣本進行蘇木素-伊紅（HE）染色：首先，分別用二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）、二甲苯（Ⅲ）處理切片5 min，再用100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇以及70%乙醇各處理2 min，用流水沖洗5 min后，放入蘇木精液中染色5 min，用流水沖洗去蘇木精液，再放入1%的鹽酸乙醇中快速處理3 s，用流水沖洗至切片返藍，再用0.5%伊紅液染色3 min，再用蒸餾水稍洗，再用80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇快速處理各2 s，再用二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）和二甲苯（Ⅲ）各處理2 min，最后用中性樹膠封固，置于光學顯微鏡下觀察。

1.3 microRNA的表達檢測 使用Qiagen公司生產的miRNeasy Mini Kit試劑盒進行microRNA的提取，嚴格按照的產品說明書進行microRNA的富集。對所得到的microRNA進行反轉錄處理，反轉錄系統中包括反轉錄Buffer、RNA樣本、MMLV反轉錄酶、dNTP、反轉錄引物以及RNA酶抑制劑，用DEPC水補齊至25 μL體系。反轉錄過程為為42 ℃ 50 min，70 ℃ 10 min，最后置于4 ℃。以cDNA為模板，進行實時定量PCR檢測，所用的試劑盒購自北京全式金生物科技公司，嚴格按照說明書進行操作，最后在LightCycler Real Time PCR擴增儀進行檢測。

1.4 Western blot檢測PTEN的表達 先將牙周組織用組織勻漿機磨碎，再加入預冷的RIPA裂解液，震蕩使其充分裂解后，加入上樣緩沖液煮沸。進行SDS-PAGE電泳，待溴酚藍染料遷移至底部時關閉電源，小心的將凝膠取出，并進行電轉，將凝膠上的蛋白質轉移至硝酸纖維膜上，后將硝酸纖維膜置于脫脂牛奶封閉液中封閉1 h。再加入一抗（抗CTSK單克隆一抗購自Santa Cruz公司，貨號：sc-48353），于4 ℃孵育過夜，用緩沖液沖洗硝酸纖維膜3遍后，然后在加入相應的二抗孵育1 h，用緩沖液沖洗硝酸纖維膜3遍后進行曝光檢測。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用ANOVA單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠牙周組織形態及壓力側破骨細胞數量的變化 由HE染色結果可見，與對照組相比，正畸組中牙周組織形態（圖1）發生明顯改變，破骨細胞數量（圖2）較多，并且體積稍大。然而在微創組中，牙周組織形態更偏向于對照組，并且破骨細胞數量較少，體積也略有減小。這說明微創外科技術對大鼠牙周組織形態改變較小，并且能夠減少壓力側破骨細胞數量，提示微創外科技術正畸治療療效可能更好。

*與對照組比較，P<0.05

2.2 組織蛋白酶K表達的變化 通過免疫組織化學的方法檢測牙周組織中組織蛋白酶K的表達豐度，與對照組相比，正畸組中組織蛋白酶K的表達明顯升高；微創組組織蛋白酶K的水平較正畸組明顯降低，見圖3。為了確保實驗數據的準確性，筆者使用組織勻漿器將牙周組織磨碎，每組中挑選任意兩個樣本，通過Western blot技術檢測組織蛋白酶K的表達量，結果與免疫組化的結果一致，即正畸組中組織蛋白酶K表達較對照組高，而微創組中組織蛋白酶K表達較正畸組低，見圖4。endprint

2.3 牙周組織中microRNA表達紊亂 本研究結果顯示：與對照組相比，正畸組中幾乎所有的microRNA表達均出現改變，其中miR-21和miR-126表達上調，上調最明顯的是miR-21；miR-32和

miR-147的表達則未見明顯改變（P>0.05）；另外兩種microRNA，即miR-17和miR-155表達明顯下調，其中miR-17的下降趨勢最明顯。然而在微創組中，幾種microRNAs的表達趨勢較正畸組有很大不同，但是有趣的一點是，幾種microRNAs的表達譜與對照組有相似之處，比如微創組中miR-21的表達量較正畸組明顯降低，回到對照組的表達水平；盡管微創組中miR-17的表達水平仍維持在較低的狀態，但是與正畸組相比已經有了明顯的升高。見圖5。

圖5 牙周組織中microRNA表達紊亂

2.4 生物信息學分析 眾所周知，microRNA主要是通過與靶基因mRNA的3UTR區進行堿基互補配對，起到轉錄后的抑制作用。2.3已經介紹很多microRNAs的表達發生改變，但是它們的表達改變與組織蛋白酶K是否相關呢？筆者通過生物信息學分析，發生miR-17可能能夠直接調控組織蛋白酶K。再結合以上兩部分介紹，正畸組中組織蛋白酶K高表達伴隨有miR-17的低表達，而微創組中組織蛋白酶K表達水平較正畸組降低，同時伴隨有miR-17的表達升高。這都提示miR-17可能通過直接調控組織蛋白酶K來發揮對牙周細胞的生物學功能。

3 討論

組織蛋白酶K是由前多肽原的復合體經加工后形成的一種成熟形式的單體蛋白質，骨吸收腔隙中的酸性環境有利于組織蛋白酶K的激活[5]。組織蛋白酶K是破骨細胞中高表達量的具有很強溶骨活性的半胱氨酸蛋白酶，能降解骨基質中的骨連接素和骨橋接素，是在骨吸收過程中發揮重要作用的關鍵酶[6]。

組織蛋白酶K在哺乳類動物的發育中發揮重要作用，該基因敲除小鼠中骨吸收功能缺陷，出現骨基質降解障礙的特征，導致骨硬化癥等疾病。相反，組織蛋白酶K持續性高表達則會加速小鼠干骺端骨小梁的轉換，引發骨質疏松癥等疾病[7]。此外，血清中蛋白酶K水平與骨密度表現出一定的相關性，可以使用血清中蛋白酶K水平作為預測骨折風險的標志物[8-10]。很多證據都證明，組織蛋白酶K可以作為治療骨吸收疾病的一個重要靶點。

最近研究證實，織織蛋白酶K在口腔臨床中也有重要生物學作用，比如，組織蛋白酶K在乳恒牙的替換中發揮了重要作用。破骨和破牙細胞中，組織蛋白酶K能夠發揮蛋白水解酶的功能，水解Ⅰ型膠原等骨基質蛋白，在破骨細胞以及破牙細胞的形成過程中發揮重要作用[11]。此外，根吸收現象，尤其是上前牙根吸收現象在幾乎所有的正畸患者中普遍存在，牙根吸收會引起牙冠根比減小，降低穩定性，嚴重的甚至會引起牙齒松動脫落。正畸牙移動主要包括溶解礦化物和降解膠原纖維兩個過程，而組織蛋白酶K主要發揮降解膠原纖維的作用，因此組織蛋白酶K在此過程中作用尤為重要[12]。本文發現組織蛋白酶K在正畸組和微創組中表達有差別，提示可能微創組對牙周組織的作用可能稍微小一些，這可能與治療過程中破骨細胞和破牙細胞的數量等相關。

近年來，關于microRNA在生理以及病理狀態中的功能研究越來越成為生命科學領域研究的熱點。在成骨分化發生的第3、7、14天，miR-17的表達與在對照組出現明顯降低[13-15]；miR-21則能夠在拉力牽張介導的人牙周膜干細胞成骨誘導分化過程中發揮重要功能[16]；miR-155則在牙髓，牙齦和體外牙周膜細胞中呈現出組織依賴性的高表達[9，17-18]；在人患病牙周組織和健康的牙周組織中，miR-126，miR-32，miR-147和miR-155出現表達紊亂[19-20]。這提示microRNA可能參與了正畸治療牙移動過程。通過qRT-PCR對幾種microRNA表達改變的影響，肯定了miR-17和miR-21可能參與了該過程，并且生物學預測也顯示miR-17可能參與了對組織蛋白酶K的調節。

本研究結果初步顯示，與常規正畸方法相比，微創組中組織蛋白酶K表達水平較正畸組降低，同時伴隨有miR-17的表達升高，這表明超聲微創外科技術能夠促進牙周組織改建，縮短牙周組織損傷的修復過程。其促進牙周組織改建的相關因子級聯效應，有待于進一步探究。

參考文獻

[1] Garg G，Pradeep A R，Thorat M K.Effect of nonsurgical periodontal therapy on crevicular fluid levels of Cathepsin K in periodontitis[J].Arch Oral Biol，2009，54（11）：1046-1051.

[2] Mogi M，Otogoto J.Expression of cathepsin-K in gingival crevicular fluid of patients with periodontitis[J].Arch Oral Biol，2007，52（9）：894-898.

[3] Tsuchiya M，Akiba Y，Takahashi I，et al.Comparison of expression patterns of cathepsin K and MMP-9 in odontoclasts and osteoclasts in physiological root resorption in the rat molar[J].Arch Histol Cytol，2008，71（2）：89-100.

[4] Tsuji Y，Yamaza T，Kido M A，et al.Expression of cathepsin K mRNA and protein in odontoclasts after experimental tooth movement in the mouse maxilla by in situ hybridization and immunoelectron microscopy[J].Cell Tissue Res，2001，303（3）：359-369.endprint

[5] Beklen A，Al-Samadi A，Konttinen Y T.Expression of cathepsin K in periodontitis and in gingival fibroblasts[J].Oral Dis，2015，21（2）：163-169.

[6] Hao L，Chen J，Zhu Z，et al.Odanacatib，Cathepsin K Specific Inhibitor，Inhibits Inflammation and Bone Loss Caused by Periodontal Diseases[J].J Periodontol，2015，86（8）：972.

[7] Lv S，Liu H，Cui J，et al.Histochemical examination of cathepsin K，MMP1 and MMP2 in compressed periodontal ligament during orthodontic tooth movement in periostin deficient mice[J].J Mol Histol，2014，45（3）：303-309.

[8] Yamalik N，Gunday S，Kilinc K，et al.Analysis of cathepsin-K levels in biologic fluids from healthy or diseased natural teeth and dental implants[J].Int J Oral Maxillofac Implants，2011，26（5）：991-997.

[9] Marchesan J T，Gerow E A，Schaff R，et al.Porphyromonas gingivalis oral infection exacerbates the development and severity of collagen-induced arthritis[J].Arthritis Res Ther，2013，15（6）：R186.

[10] Baek J E，Choi J Y，Kim J E.Skeletal analysis and differential gene expression in Runx2/Osterix double heterozygous embryos[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，451（3）：442-448.

[11] Xue Y，Wang L，Xia D，et al.Dental Abnormalities Caused by Novel Compound Heterozygous CTSK Mutations[J].J Dent Res，2015，94（5）：674-681.

[12] Hao L，Zhu G，Lu Y，et al.Deficiency of cathepsin K prevents inflammation and bone erosion in rheumatoid arthritis and periodontitis and reveals its shared osteoimmune role[J].FEBS Lett，2015，589（12）：1331-1339.

[13] Chao D，Yan W，Kun Y，et al.Effect of microRNA-17 on osteogenic differentiation of advanced glycation end products-stimulated human periodontal ligament stem cells[J].West China Journal of Stomatology，2015，33（1）：21-24.

[14] Krishnan S，Pandian S，Kumar S A.Effect of bisphosphonates on orthodontic tooth movement-an update[J].J Clin Diagn Res，2015，9（4）：ZE01-5.

[15] Patil A K，Shetty A S，Setty S，et al.Understanding the advances in biology of orthodontic tooth movement for improved ortho-perio interdisciplinary approach[J].J Indian Soc Periodontol，2013，17（3）：309-318.

[16] Wei F，Liu D，Feng C，et al.MicroRNA-21 mediates stretch-induced osteogenic differentiation in human periodontal ligament stem cells[J].Stem Cells Dev，2015，24（3）：312-319.

[17] Sipert C R，Morandini A C，Dionisio T J，et al.MicroRNA-146a and microRNA-155 show tissue-dependent expression in dental pulp，gingival and periodontal ligament fibroblasts in vitro[J].J Oral Sci，2014，56（2）：157-164.

[18] Nagatake T，Fukuyama S，Sato S，et al.Central Role of Core Binding Factor β2 in Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Organogenesis in Mouse[J].PLoS One，2015，10（5）：

e0 127 460.

[19] Xie Y F，Shu R，Jiang S Y，et al.Comparison of microRNA profiles of human periodontal diseased and healthy gingival tissues[J].Int J Oral Sci，2011，3（3）：125-134.

[20] Yang X，Wang Y，Han X，et al.Effects of TGF-β1 on OPG/RANKL expression of cementoblasts and osteoblasts are similar without stress but different with mechanical compressive stress[J].Scientific World Journal，2015：718 180.

（收稿日期：2017-06-28） （本文編輯：鄧朝陽）endprint