Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β—catenin通路在子宮內膜癌患者中的作用機制研究

盧宇青

【摘要】 目的：觀察Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路在子宮內膜癌患者中的表達及作用機制。方法：選取2015年1月-2016年7月醫院收治子宮內膜癌患者102例，均經過病理確診，設為觀察組，其中95例雌激素依賴型子宮內膜癌，7例非雌激素依賴型子宮內膜癌。選取同期入院子宮內膜增生疾病診斷患者48例，設為對照組。入院后采集相關標本，制作組織芯片，采用免疫組化SP法檢測兩組Wnt10a/Wnt10b表達水平，采用Western-blot法檢測不同組織標本關鍵蛋白的表達含量。結果：觀察組中Wnt10a及Wnt10b陽性表達率，高于對照組（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴型子宮內膜癌Wnt10a陽性率，高于非雌激素依賴型子宮內膜癌（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴型子宮內膜癌Wnt10b陽性率，低于非雌激素依賴型子宮內膜癌（P<0.05）；Wnt10a在觀察組中呈陽性表達，組織排列無規律性，在對照組中呈陰性表達，組織排列相對整齊。Wnt10b在觀察組中多呈陽性表達，組織排列缺乏規律性，對照組中呈陰性表達，組織排列相對整齊。Western-blot法結果顯示，子宮內膜癌患者中，Wnt10b表達水平增加，并且β-catenin及c-myc表達均得到增加，APC表達下降。結論：Wnt10a/Wnt10b在子宮內膜癌發生、發展中發揮了重要作用，其機理與經典Wnt/β-catenin信號傳導通路激活有關。

【關鍵詞】 Wnt10a/Wnt10b； Wnt/β-catenin通路； 子宮內膜癌； 表達； 作用機制

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.19.007

子宮內膜癌（EC）是原發于子宮內膜的上皮性惡性腫瘤，是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，好發于58～61歲人群中，隨著人口老齡化的日益加劇，導致EC發生率呈現上升及年輕化趨勢[1]。有關報道顯示，EC發生率占女性癌癥總數的20.0%～30.0%，其發生率已經超過宮頸癌發生率[2-3]。臨床上，根據發病原因將EC分為雌激素依賴型（Ⅰ型，占85.0%）和非雌激素依賴型（Ⅱ型）。目前，臨床上對于EC發病機制尚不完全知曉，多與肥胖、持續性雌激素刺激、高血壓及糖尿病有關。文獻[4-5]報道顯示，Wnt基因及經典傳導通路在結直腸癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌中發揮了重要的作用，該通路中關鍵蛋白β-catenin的失活突變在EC中約占10.0%～45.0%，但是其作用機制尚存在較大的爭議。為了探討Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路在子宮內膜癌患者中的表達及作用機制，選取2015年1月-2016年7月本院收治子宮內膜癌患者102例，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月-2016年7月本院收治子宮內膜癌患者102例，其中95例雌激素依賴型子宮內膜癌，7例非雌激素依賴型子宮內膜癌；年齡35～78歲，平均（58.5±4.1）歲。納入標準：（1）符合子宮內膜癌臨床診斷標準[6-7]；（2）均經過生化指標、影像學檢查及組織形態學檢查得到確診；（3）均伴有不同程度的陰道不規則出血、下腹痛、月經紊亂等；（4）本課題均經過醫院倫理委員會批準同意，自愿簽署知情同意書。排除標準：（1）不符合子宮內膜癌臨床診斷標準者；（2）資料不全或難以配合治療者；（3）合并心、肝、腎功能異常者。選取同期入院子宮內膜增生疾病診斷患者48例，設為對照組，年齡34～79歲，平均（59.1±4.4）歲。兩組患者的年齡比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2 方法 入院后采集相關標本，制作組織芯片，采用免疫組化SP法檢測兩組Wnt10a/Wnt10b表達水平；采用Western-blot法檢測不同組織標本Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白的表達含量。（1）組織芯片制備：取兩組手術病理切除組織，對蠟塊的HE切片做鏡下形態學觀察，圈出EC組織及非EC組織的形態學特點的位置，在蠟塊上確定取樣的部位，利用組織芯片打孔儀對蠟塊穿取組織芯[8]。（2）Wnt10a/Wnt10b表達水平：將組織芯片蠟塊以3 μm連續切片，將獲得的標本完整切片進行常規HE染色，然后采用免疫組化SP法檢測兩組Wnt10a/Wnt10b表達水平，將芯片內不同類型組織作為內對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，相關操作步驟必須嚴格遵循儀器、試劑盒操作說明進行[9-10]。（3）Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達：采用Western-blot法檢測不同組織標本關鍵蛋白的表達含量，取上述采集的標本組織，根據50體積BCA試劑A試劑B配制BCA工作液，充分混勻。完全溶解BSA蛋白標準品，取10 μL稀釋到100 μL，控制最終濃度為0.5 mg/mL。將標準品根據0、1、2、4、8、12、16 μL加入到96孔板中，向每孔中加入200 μL BCA工作液，37℃下進行30 min放置，采用酶標儀測定波長在592 nm下的吸光度值。將上述標本采用SDS-聚丙烯酰胺蛋白經過制膠、上樣、電泳，制備半干式電轉膜，將其放入封閉液中，采用TBST進行3次沖洗，5 min/次，采用封閉液稀釋一抗，放入4 ℃下孵育過夜，搖床上輕微振動。利用封閉液稀釋辣根過氧化物酶標記二抗IgG，混合在1 mL雙蒸餾水中，使之完全覆蓋PVDF膜，在暗室內曝光、顯影、定影[11-12]。

1.3 結果判定 采用PBS液置換一抗作為陰性對照，采用Wnt10a染色已知結腸癌組織切片作為陽性對照，Wnt10b采用已知陽性乳腺癌組織作為陽性對照[13]。

1.4 統計學處理 使用SPSS 18.0統計軟件進行處理，計量資料采用（x±s）表示，比較行t檢驗，計數資料采用率（%）表示，比較采用檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果endprint

2.1 兩組Wnt10a及Wnt10b表達情況比較 觀察組中Wnt10a及Wnt10b陽性表達率，高于對照組（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴型子宮內膜癌Wnt10a陽性率，高于非雌激素依賴型子宮內膜癌（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴型子宮內膜癌Wnt10b陽性率，低于非雌激素依賴型子宮內膜癌（P<0.05），見表1。

2.2 Wnt10a及Wnt10b在兩組中的表達情況 采用免疫組織化學SP法測定Wnt10a及Wnt10b在兩組中的表達，Wnt10a在觀察組中呈陽性表達，組織排列無規律性，在對照組中呈陰性表達，組織排列相對整齊。Wnt10b在觀察組中多呈陽性表達，組織排列缺乏規律性，對照組中呈陰性表達，組織排列相對整齊，見圖1。

2.3 Wnt/β-catenin通路在子宮內膜癌患者中的表達 通過采用Western-blot法檢測不同組織標本關鍵蛋白的表達含量，結果顯示：子宮內膜癌患者中，Wnt10b表達水平增加，并且β-catenin及c-myc表達均得到增加，APC表達下降，見圖2。

3 討論

子宮內膜癌（EC）是臨床上常見的惡性腫瘤，患者發病早期臨床癥狀缺乏特異性，多數患者一旦確診已經是中、晚期，從而錯過了最佳治療時機[14]。文獻[15-16]報道顯示：Wnt10a/Wnt10b及Wnt/β-catenin信號傳導在EC的發生、發展有關，能促進腫瘤的發生，但是其具體機制尚存在較大的爭議。Wnt基因最早由國外學者在1982年發現并報道，是小鼠乳腺癌中克隆出的一種原癌基因，能在細胞間傳遞增殖分化信號的蛋白質，成為Int基因。Wnt10a/Wnt10b均為Wnt基因家族中比較重要的成員，其傳代信號能引起細胞內β-catenin水平升高并進入核內，通過與TCF結合，調節相關靶基因控制其轉錄和表達，從而影響細胞的增殖和凋亡，通過這種途徑能激活細胞內信號通路。文獻[16]報道顯示，Wnt信號蛋白在多種惡性腫瘤中表達增高。Wnt10a在胃癌和結直腸癌的研究相對較多，而在子宮內膜癌的表達研究較少，多與腫瘤的直徑、浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度及5年生存率有關。從本課題研究結果看出：Wnt10a在子宮內膜癌發生中能發揮一定的作用，并且Wnt10b在正常子宮內膜到異常增生子宮內膜直到癌變子宮內膜均具有較高的陽性表達率，提示Wnt10b能促進子宮內膜的發生及發展[17]。本研究中，觀察組Wnt10a及Wnt10b陽性表達率，高于對照組（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴型EC Wnt10a陽性率，高于非雌激素依賴型EC（P<0.05）；觀察組中雌激素依賴型EC Wnt10b陽性率，低于非雌激素依賴型子宮內膜癌（P<0.05）。

EC被認為是一種雌激素依賴性腫瘤，其發生于發展和Wnt信號傳統通路之間可能屬于是一種無抵抗雌激素導致Ⅰ型EC的機制之一。Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路通過促進Wnt基因及蛋白的表達，能進一步提高Wnt信號傳導通路的活化，有助于靶基因關鍵蛋白水平的提高，從而能促進子宮內膜組織的惡性轉化[18]。β-catenin通路最初是作為細胞黏附分子被人們認識的，因近年發現其在Wnt/β-catenin信號傳導通路及某些腫瘤的發生中具有重要的作用而廣泛受到關注。從大的角度來說，β-catenin是由CTNNB1基因編碼，主要定位于染色體3P21、3P22中，該因子具有16個外顯子，全長2312Kb，分子量為92-95KD，含有781個氨基酸。β-catenin蛋白主要是通過結合型與游離型的方式存在于細胞漿中，能與Ecadherin相互作用，并且能直接將細胞外粘附因子與胞質內的細胞骨架相互結合，從而在細胞膜表面形成復合體，有助于維持上皮細胞極性和完整性。同時，游離的β-catenin能與GSK3β，APC和Axin形成復合物，復合物中的β-catenin可以被磷酸化，從而被蛋白酶體降解。有關研究顯示，β-catenin是經典Wnt/β-catenin信號通路的下游中相對重要的蛋白之一，在Wnt信號通路中發揮了重要的作用，通過β-catenin核內水平的增加能引起一系列轉錄基因活性的增強，誘導細胞發生惡性病變。有關研究顯示，Wnt/β-catenin在肝癌、食管癌、結直腸癌、胰腺癌及EC中均具有異常表現，并且其異常表達與腫瘤的發生、發展關系密切。本研究中，通過采用Western-blot法檢測不同組織標本關鍵蛋白的表達含量，結果顯示EC患者中，Wnt10b表達水平增加，并且β-catenin及c-myc表達均得到增加，APC表達下降。由此看出：Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路在EC患者中參與雌激素水平的調節，促進腫瘤的發生及發展。

綜上所述，Wnt10a/Wnt10b在EC發生、發展中發揮了重要作用，其機理與經典Wnt/β-catenin信號傳導通路激活有關，能促進β-catenin表達水平，促進子宮內膜癌發生及發展。

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（收稿日期：2017-02-14） （本文編輯：周亞杰）endprint