外周血p73基因聯合CEA檢測在結直腸癌早期篩查中的意義

龍海華　賈安平　尹琦　龐麗萍　劉振鵬

【摘要】 目的：探討外周血p73基因甲基化聯合CEA檢測在結直腸癌早期篩查中的臨床意義。方法：選取2013年6月-2017年3月本院住院患者142例，將其分為結直腸癌組64例和結直腸瘤組78例，另選取健康體檢者142例為健康對照組。采用甲基化特異性PCR（MSP）對所有受檢者行血漿p73基因甲基化檢測，并測定血清CEA。比較單獨與聯合檢測聯合血漿p73基因甲基化及血清CEA對結直腸癌的診斷準確性、陰性預測值、敏感性及特異性。結果：結直腸癌組血漿p73基因甲基化、血清CEA和聯合檢測的陽性率均明顯高于結直腸瘤組和健康對照組，差異均有統計學意義（P<0.001）；且結直腸瘤組均明顯高于健康對照組，差異均有統計學意義（P<0.001）。聯合血漿p73基因甲基化測定和血清CEA對結直腸癌的診斷敏感性優于單獨檢測（ 字2=9.581、16.762，P<0.01）；陰性預測值高于單獨檢測，特異性低于單獨檢測，但差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：聯合血漿p73基因甲基化測定及血清CEA對結直腸癌的早期篩查有重要的臨床意義。

【關鍵詞】 p73基因； 甲基化； 結直腸癌； 聯合檢測

Diagnostic Value of Peripheral Blood p73 Gene Methylation Combined with CEA in Early Screening of Colorectal Cancer/LONG Hai-hua，JIA An-ping，YIN Qi，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（27）：119-122

【Abstract】 Objective：To explore the diagnostic value of peripheral blood p73 gene methylation combined with CEA in early screening of colorectal cancer.Method：142 cases of hospitalized from June 2013 to March 2017 were selected，they were divided into colorectal cancer group（64 cases） and colorectal tumor group（78 cases），another 142 healthy subjects were selected as healthy control group.The methylation specific PCR（MSP） was used to detect plasma p73 gene methylation in all subjects，and the serum CEA was determined.The diagnostic accuracy，negative predictive value，sensitivity and specificity of the single and combined plasma p73 gene methylation positive rate and serum CEA of colorectal cancer were compared.Result：The positive rate of p73 gene methylation，serum CEA and joint detection in colorectal cancer group were significantly higher than those in colorectal tumor group and healthy control group，the differences were statistically significant （P<0.001）；and the colorectal tumor group was significantly higher than the healthy control group，the difference was statistically significant（P<0.001）.Joint p73 gene methylation determination of plasma and serum CEA was superior to the single detection for diagnosis of colorectal cancer susceptibility（ 字2=9.581，16.762，P<0.01）；the negative predictive value was higher than that of the individual，and the specificity was lower than that of the individual，but the differences were not statistically significant（P>0.05）.Conclusion：Plasma p73 gene methylation measurement combined with of serum CEA has important clinical significance for early screening of colorectal cancer.

【Key words】 p73 gene； Methylation； Colorectal cancer； Combination of detecting

First-authors address：Liutie Central Hospital of Liuzhou City，Liuzhou 545007，Chinaendprint

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.27.034

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是消化道常見的惡性腫瘤，2015年我國CRC發病率呈明顯上升趨勢[1-2]，早期診斷CRC的患者5年生存率可達90%[3]。p73基因啟動子甲基化的異常與腫瘤的發生、發展密切相關[4-7]，而CEA是消化道腫瘤的重要腫瘤標準物[8-11]。本研究對外周血p73基因甲基化狀態及血清CEA進行檢測，觀察聯合兩種檢測對CRC早期篩查的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月-2017年3月本院住院患者142例，患者均無明確惡性腫瘤疾病史，未接受放療、化療及免疫抑制等治療。以組織病理學為依據，將其分為結直腸癌組64例，男36例，女

28例，年齡31～85歲，中位年齡52歲；結直腸瘤組78例，男43例，女35例，年齡27～88歲，中位年齡47歲；另選取健康體檢者142例為健康對照組，男67例，女75例，年齡25～89歲，中位年齡42歲。本研究經醫院倫理委員會審核批準，在采集外周血及組織標本前宣教本研究目的及意義，取得受檢者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 病理活檢確診結直腸癌患者均行外科手術治療，包括根治術加周圍淋巴結清掃及姑息手術；確診結直腸瘤患者行腸鏡下息肉切除術或黏膜剝離術，病理提示切緣無癌細胞者予臨床隨訪，病理提示找到癌細胞則追加手術，納入結直腸癌組。

1.2.2 標本處理 治療前受檢者均空腹抽取外周靜脈血10 mL，其中5 mL全血靜止分層后，3000 r/min，離心5 min分離血漿，置于-20 ℃冰箱保存，使用時將冷凍血漿置于室溫30 min后利用血清/血漿游離DNA提取試劑盒（北京天根生化科技，貨號：DP339）對DNA進行裂解、磁珠結合、洗滌、洗脫等處理，獲得DNA洗脫液，保存于-20 ℃冰箱中；另5 mL全血送生化室進行血清CEA檢測。

1.2.3 亞硫酸鹽轉化 按照DNA重亞硫酸鹽轉化試劑盒（北京天根生化科技，貨號：DP215-02）說明書進行操作，經3次洗滌及1次洗脫后回收亞硫酸鹽轉化的DNA洗脫液，封存于96孔板，置于-80 ℃保存。

1.2.4 p73基因甲基化特異性PCR（MSP） 將符合要求的血漿標本送本院生化免疫室，按甲基化特異性PCR試劑盒（北京天根生化科技，貨號：EM101-01）說明書進行操作。PCR條件：94 ℃熱啟動20 min，62 ℃ 5 s，56 ℃ 35 s，93 ℃ 30 s，45個循環，40 ℃ 5 s。電泳蒼梧行4%瓊脂糖電泳，使用Bio-Rad公司Gel DoTM XR凝膠成像系統分析后進行測序。引物序列參照文獻[12]，由北京天根生化科技公司合成，非甲基化引物（p73-U），F：5-AGGGGATGTAGTGAAATTGGGGTTT-，R：5-CCATCACAACCCCAAACATCA-3，擴增產物69 bp；甲基化引物（p73-M），F：5-GGACGTAGCGAAATCGGGGTTC-3，R：5-ACCCCGAACATCGACGTCCG-3，擴增產物60 bp。

1.3 觀察指標與判定標準 p73甲基化及非甲基化預測的目標片段大小分別為60、69 bp。將擴增產物條帶的大小與預測的目標片段大小進行比對，特異性擴增產物中出現大小為60 bp的擴增片段，無論是否含有69 bp大小的擴增片段，均判為p73甲基化陽性，特異性擴增片段只有大小為69 bp的擴增片段，則判為p73甲基化陰性。血清CEA>5 μg/L為陽性標準。聯合檢測時，如有1項檢測結果陽性即判為聯合檢測陽性，檢測結果均陰性才判為聯合檢測陰性。敏感性=結直腸癌組中陽性例數/結直腸癌總例數×100%；特異性=非結直腸癌組中陰性例數/非結直腸癌組總例數×100%；陽性預測值=[結直腸癌組中陽性例數/（結直腸癌組中陽性例數+非結直腸癌組中假陽性例數）]×100%；陰性預測值=[非結直腸癌組中真陰性例數/（結直腸癌組中假陰性例數+非結直腸癌組中真陰性例數）]×100%。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗或Kruskal-Wallis檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組的血漿p73基因甲基化及血清CEA陽性率比較 結直腸癌組血漿p73基因甲基化、血清CEA和聯合檢測陽性率均明顯高于結直腸瘤組和健康對照組，差異均有統計學意義（ 字2=16.473、18.192、33.199，P<0.001； 字2=83.700、68.700、129.633，P<0.001）；且結直腸瘤組均明顯高于健康對照組，差異均有統計學意義（ 字2=24.957、13.958、33.956，P<0.001）；結直腸癌組中聯合血漿p73基因甲基化測定和血清CEA的陽性率均高于單獨檢測，差異均有統計學意義（ 字2=14.083、9.524，P<0.01）；結直腸瘤組中，聯合血漿p73基因甲基化測定和血清CEA的陽性率高于單獨檢測血清CEA的陽性率，差異有統計學意義（ 字2=7.692，P<0.01），與單獨檢測血漿p73基因甲基化的陽性率比較，差異無統計學意義（ 字2=1.973，P>0.05）；健康對照組中，聯合血漿p73基因甲基化測定和血清CEA的陽性率與單獨檢測比較，差異均無統計學意義（ 字2=0.851、0.890，P>0.05）。見表1。

2.2 血漿p73基因甲基化及血清CEA對CRC診斷的陽性預測值、陰性預測值、敏感性及特異性比較 血漿p73基因甲基化+血清CEA聯合檢測對結直腸癌的診斷敏感性高于單獨檢測，差異均有統計學意義（ 字2=9.581、16.762，P<0.01）；對診斷結直腸癌的陰性預測值高于單獨檢測，特異性低于單獨檢測，但差異均無統計學意義（P>0.05），見表2。endprint

3 討論

隨著分子生物學的發展，人們發現在腫瘤發展出現形態改變之前，往往先有癌基因的激活和抑癌基因的失活，對這些基因進行檢測，將有助于結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）的早期診斷[13]。CRC發生發展是內外環境的多種因素共同參與、多階段變化積累的過程，目前仍未明確其確切的發病機制。選擇檢測哪種基因，從什么標本中獲取該基因才能最有效地協助CRC的早期診斷和篩查已成為人們關注的焦點。由于外周血及糞便中檢測基因甲基化的可行性強，目前外周血基因檢測SEPT9基因已作為CRC早期診斷的檢測指標進入臨床運用階段并納入指南[14]。隨著科學技術不斷發展，更多的甲基化標志物將不斷被發現并與基因進行聯合檢測，有助于CRC的早期診斷及有效治療[15]。

p73是抑癌基因p53家族中的成員，它的缺失或失活可活化癌基因，使細胞生長失控，導致惡性腫瘤的發生和發展[16]。因為腫瘤細胞DNA可釋放入外周血，因此在患者血清和血漿內可以檢測到的較高濃度的DNA異常甲基化[17]，腫瘤組織中DNA異常甲基化發生更早、準確性更高，但組織學標本相對較難留取，主要受內鏡檢查條件、患者接受程度等客觀條件影響，而內鏡檢查本身又受到患者腸道準備情況、病灶所處部位、檢查者技術水平及檢查時間等因素的影響，而且還存在出血、穿孔等內鏡檢查并發癥，患者依從性差。外周血的標本取材更簡單、方便、快捷、微創，尋找外周血結直腸癌特異性分子標志物對提高CRC的早期診斷有重要意義。本研究中，p73基因甲基化陽性率在結直腸癌組外周血中表達最高，其次為結直腸瘤組，健康對照組中p73基因甲基化陽性率較低。由此可見，在癌前病變時期就有一定的發現率，可作為報警指標，利于早期發現瘤或癌的病變，幫助CRC的早診斷及早治療，但敏感性僅57.81%。將血漿p73基因甲基化測定與血清CEA聯合，其診斷結直腸癌的敏感性優于單獨檢測（ 字2=9.581、16.762，P<0.01），體現了聯合檢測的優勢。因此，血漿CEA聯合血清p73基因甲基化檢測可能更能適合CRC大范圍篩查的需要。

隨著科學技術不斷發展，更多的甲基化標志物將不斷被發現[18-19]。這些標志物不受性別、年齡、腫瘤部位的影響，聯合檢測將有助于CRC的早期診斷及有效治療。本研究中，血漿p73基因甲基化陽性率在健康對照組-結直腸瘤組-結直腸癌組中呈逐漸升高，提示p73基因與結直腸的發生、發展可能存在一定的相關性，將p73基因作為一個靶點進行干預，或許可以成為CRC早期基因治療的一個理想方法，或為結直腸癌的術后監測提供有效的腫瘤標志物。但目前研究所見，大規模無癥狀人群或輕微癥狀人群CRC篩查或早期診斷中，即使是已列入指南的血漿SEPT9基因甲基化檢測，其陽性率及敏感度仍偏低[20]。考慮到相同分子標志的甲基化情況在不同研究和不同人群之間也有一定的差異等因素[21-22]，進一步明確血漿p73基因甲基化檢測在CRC診斷中的價值，有待進行大樣本、多中心的前瞻性對照研究。

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（收稿日期：2017-07-17） （本文編輯：張爽）endprint