MYH9蛋白在胃癌中的表達及其臨床意義

劉曉平+吳平輝+周小青

【摘要】 目的：探討MYH9蛋白在胃癌組織中的表達及其臨床意義。方法：應用免疫組化及Western blot法檢測胃癌及癌旁組織中MYH9蛋白的表達水平，分析其臨床病理參數之間的關系。結果：MYH9蛋白在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織（P<0.05）。胃癌組織MYH9蛋白的表達在Ⅲ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（P=0.009），淋巴結轉移胃癌的MYH9蛋白表達明顯高于無淋巴結轉移 （P=0.019）。結論：MYH9蛋白在胃癌組織中表達增高，參與了腫瘤的轉移過程。

【關鍵詞】 胃癌； MYH9； 免疫組化

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of MYH9 protein in human gastric carcinoma.Method：The expression of MYH9 in gastric carcinoma and paraneoplastic were evaluated by immunohistochemical and Western blot，then analyzed its association with clinical pathology.Result：The expression of MYH9 in gastric carcinoma was higher than paraneoplastic（P<0.05）.The expression of MYH9 protein in stage Ⅲ-Ⅳ of gastric cancer tissues was significantly higher than that of stage Ⅰ-Ⅱ（P=0.009） and the expression of MYH9 protein in lymph node metastasis of gastric cancer was significantly higher than that of without lymph node metastasis （P=0.019）.Conclusion：Higher expression of MYH9 in gastric carcinoma may play an important role in tumor metastasis.

【Key words】 Gastric carcinoma； MYH9； Immunohistochemical

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.010

胃癌是全球最常見的腫瘤之一，我國是胃癌的高發區，發病率和死亡率居第二位和第三位，明顯高于世界平均水平[1-3]。目前胃癌的診斷和治療已經取得很大進步，而其發病率和死亡率仍無明顯降低，主要原因是胃癌常發生侵襲和轉移，且治療后容易復發。胃癌發生轉移的病因受環境因素及多種分子基因的調控。非肌性肌球蛋白重鏈-9基因（myosin heavy chain 9，nonmuscle，MYH9）定位于人染色體22q13.1，表達產物是非肌性肌球蛋白Ⅱ（non-muscle myosin Ⅱ，NMⅡ），屬于肌球蛋白（myosin）超家族[4]。MYH9在細胞極化、遷移、粘附中均有重要作用[5-8]。為了解MYH9在腫瘤的發生發展過程中的作用，本文初步探討了MYH9蛋白在胃癌組織中的表達，以判斷MYH9蛋白在胃癌侵襲轉移中發揮的作用。現報道如下

1 資料與方法

1.1 標本收集與試劑 2013年12月-2015年6月贛南醫學院第一附屬醫院手術切除并經病理證實為胃癌的石蠟包埋標本86例。患者術前均未接受放療和化療，均經病變組織活檢，診斷為胃癌。男55例，女31倒；平均年齡（59.0±4.8）歲。其中高、中分化腺癌57例，低分化腺癌29例；有淋巴結轉移者36例，無淋巴結轉移者50例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ～Ⅳ期42例。同時取距癌組織邊緣5 cm以上的癌旁胃組織20例作為對照組。抗人MYH9多克隆抗體購于Sigma公司，PV-9000試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 免疫組織化學法 所有標本應用SP法進行免疫組織化學染色，對證實為胃癌石蠟包埋的標本行4 ?m厚切片，每例連續作3張切片。一張行HE染色，以觀察細胞分化程度等病理特征。一張作陰性對照，用PBS溶液代替一抗。另一張行MYH9免疫組化染色。病理特征和免疫組化的結果由兩位病理科醫師獨立單盲閱片。隨機選取5個視野，MYH9免疫組化染色陽性物質主要定位于細胞漿內，呈棕黃色細顆粒狀。蛋白表達評估標準為：（1）按陽性染色細胞百分率計分：陽性細胞百分率≤5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；（2）按染色強度計分：0分為無色，1分為淡黃色為弱表達，2分為黃色為中表達，3分為棕黃色或黃褐色為強表達。免疫染色指數（staining index，SI）=陽性染色細胞百分率×染色強度。在本研究中，設定SI≤6分為低表達，SI>6分為高表達。

1.3 Western blot法 取術后新鮮病理標本，在腫瘤組織和癌旁組織進行取材，通過BCA法測定蛋白水平。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后， 將獲得樣品加入SDS緩沖液中，上樣，待溴酚藍跑至底部，進行轉膜后封閉、免疫反應觀察MYH9蛋白表達情況，以β-actin為內參。照相后行圖像分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗及列連表相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。endprint

2 結果

2.1 MYH9蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達 免疫組化結果顯示：MYH9主要在胃癌細胞的胞漿中表達（圖1）。86例胃癌組織，39例（45.3%）低表達，47例（54.7%）高表達；20例癌旁組織，15例（75.0%）低表達，5例（25.0%）高表達。MYH9在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差 異有統計學意義（P=0.017）。Western blot結果顯示，對20組胃癌組織及癌旁組織進行了Western blot檢測，其中13組癌組織比癌旁組織蛋白表達量高（圖2），7組癌組織MYH9蛋白表達不高于癌旁組。進一步用秩和檢驗進行分析，發現胃癌組織中MYH9蛋白的表達高于癌旁組織（15.68% vs 7.19%），差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 MYH9蛋白在胃癌中的表達與臨床病理參數之間的關系 MYH9蛋白表達與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分化程度無關（P>0.05），胃癌組織MYH9蛋白的表達在Ⅲ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（P=0.009），淋巴結轉移胃癌的MYH9蛋白表達明顯高于無淋巴結轉移（P=0.019），見表1。

3 討論

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤。由于各種因素，我國大部分胃癌診斷時已是中晚期，目前的治療方式主要是以手術治療為主的綜合治療，然而仍有60%的患者依然出現復發轉移[9]。因此，了解胃癌的侵襲轉移的分子機制，是胃癌研究者面臨的重大課題[10-11]。Liang等[12]通過體內和體外實驗研究發現Let-7f 通過介導MYH9基因從而抑制胃癌細胞GC9811的侵襲與轉移，這為胃癌侵襲轉移的機制研究又提供了一關聯基因。為此，本文初步探討MYH9蛋白在胃癌組織中的表達，用以明確MYH9蛋白在胃癌侵襲轉移中發揮的作用。

肌球蛋白（myosin）超家族可與肌動蛋白相結合，利用ATP水解的能量，沿著微絲移動，參與細胞內的各種功能都相關[13]。研究發現，MYH9特異的存在于血小板、淋巴細胞和中性粒細胞中，參與了細胞的運動和趨化。它還與其他蛋白相互作用，促進細胞定向的運動，調節腫瘤細胞的遷移和血管的生成[14-15]。而這些作用主要是由MYH9基因編碼的NMIIA族分子完成的。NMIIA通過組裝成肌球蛋白牽引整個細胞，形成類蜂窩結構，收縮細胞體向前運動，解離附著在細胞后部的尾巴，從而達到細胞的收縮和前行運動[16]。是否MYH9在腫瘤的發生發展過程中也是通過NMIIA族分子發揮作用的仍不清楚。目前MYH9基因與腫瘤的生物學行為研究一直是熱點之一。MYH9蛋白是表達兒童間變性大細胞淋巴瘤激酶的融合基因[17]，在乳癌和黑色素瘤細胞系中MYH9蛋白又是依賴其他因子的表達[18]。進一步研究顯示，MYH9是腫瘤的候選癌基因，在肺癌和大腸癌的侵襲轉移中發揮重要的作用[19-21]。

本課題中對胃癌及癌旁組織中進行MYH9的免疫組化檢測，結果發現MYH9在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。Western blot法是分子生物學和生物化學等領域研究中常用的一種實驗方法，常用來分析基因在蛋白水平的表達情況。筆者進一步通過Western blot的方法驗證在胃癌組織和癌旁組織中MYH9蛋白的表達情況，結果也表明MYH9蛋白在胃癌組織中的表達是上調的，從另一個角度也驗證了蛋白質組學結果的可靠性和準確性。同時筆者還分析了MYH9蛋白在胃癌中的表達與臨床病理參數之間的關系，統計學分析提示MYH9蛋白表達與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分化程度無關，而與臨床分期及淋巴結轉移有相關性。同時也發現在轉移性淋巴結胃癌組織中，高表達的MYH9蛋白有69.4%，預示著MYH9蛋白可能在胃癌的淋巴結轉移過程發揮著重要作用。MYH9在胃癌組織中的表達可作為腫瘤診斷和判斷預后的標志物之一，但其作用機制是否也是通過結合NMIIA族分子，這也是醫務工作者進一步亟待研究的。

腫瘤的侵襲轉移是一個多步驟的復雜過程，本研究通過免疫組織方法初步探討了MYH9在胃癌侵襲和轉移中發揮了作用。下一步，還將采用多種實驗方法進一步研究MYH9蛋白在胃癌侵襲和轉移中的作用機制。期待能夠找到一種有效判斷進展期胃癌轉移相關基因的靶標，對于預測胃癌侵襲轉移的診治及預后具有非常重要的意義，為指導胃癌亞臨床轉移的合理防治提供理論依據。

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（收稿日期：2017-08-10） （本文編輯：程旭然）endprint