煙堿與胃蛋白酶相互作用機理初步研究

韓敬美，廖曉祥，雷萍，袁大林，鄭緒東，尚善齋，李志強，湯建國，李暉，陳永寬

1 云南中煙工業有限責任公司技術中心，昆明 650231；

2 四川大學化學工程學院，成都 610064

煙堿與胃蛋白酶相互作用機理初步研究

韓敬美1，廖曉祥1，雷萍1，袁大林1，鄭緒東1，尚善齋1，李志強1，湯建國1，李暉2，陳永寬1

1 云南中煙工業有限責任公司技術中心，昆明 650231；

2 四川大學化學工程學院，成都 610064

為了探究口含煙煙堿（NIC）在人體胃部的吸收特性，配制了特定濃度的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液使其pH=2.0，并在該條件下配制不同濃度的煙堿溶液樣品，隨后用該樣品作用于胃蛋白酶，利用多種光譜學方法（分子熒光光譜、紫外光譜、紅外光譜、圓二色譜）和分子模擬對接技術觀察添加不同濃度煙堿前后胃蛋白酶的光譜學變化，初步研究了NIC與胃蛋白酶（Pepsin）相互作用機理。光譜學與分子模擬對接結果表明：1）NIC與Pepsin之間為靜態熒光猝滅機制；2）NIC與Pepsin之間通過氫鍵和范德華力自發的發生相互作用；3）NIC與Pepsin之間存在著一個高親和力的結合位點；4）NIC和Pepsin之間的相互作用不僅使Pepsin中氨基酸殘基的微環境極性增加，同時使得Pepsin多肽鏈的C=O、C-N和N-H發生了變化，進而導致Pepsin的構象和空間結構發生變化，同時NIC的加入對Pepsin活性呈明顯的增強效應。以上研究結果對口含煙產品開發、質量控制和安全評價具有重要理論意義。

煙堿；胃蛋白酶；光譜學；分子對接；作用機理

煙堿(NIC)，又名尼古丁，是煙草重要成分之一，進入人體后經由血液傳送，并通過血腦屏障，可到達腦部，起到興奮、鎮靜等作用，從而致使人們吸煙上癮[1-2]。研究表明，無論是動物還是人類都會對煙堿產生耐受性、依賴性和明顯的戒斷癥狀[3-4]。口含煙作為一種重要的無煙煙草制品類型，不同于傳統卷煙煙氣的口腔-肺呼吸道吸收模式，主要為口腔-胃腸消化道吸收模式（圖1），口含煙煙堿由口腔攝入后，一部分通過口腔釋放和吸收，一部分經胃腸道進一步吸收及代謝。當煙堿含量超過一定濃度時易引起人體胃腸道反應，如打嗝、惡心等生理效應，這種煙堿攝入模式的改變必然導致煙堿釋放、滲透及吸收等作用形式的變化，必然也會帶來機體口腔-胃腸道微環境及煙堿的藥效學改變，因此研究煙堿的胃部吸收特性對口含煙產品開發非常必要。

圖1 煙堿口腔-胃腸道吸收及作用途徑Fig.1 Oral-gastrointestinal absorption and function pathway of NIC

胃蛋白酶（Pepsin）是人胃腸道中重要的多肽水解酶，長期以來被認為是胃部疾病的攻擊因子之一[5]。煙堿自口腔攝入以后，部分進入人體胃部，可能與胃蛋白酶發生作用，目前煙堿與胃蛋白酶的相互作用研究尚未見報道，本文在前期研究基礎上[6-7]，在pH=2.0的條件下，利用分子熒光光譜、紫外光譜、紅外光譜、圓二色譜及分子模擬對接等多種方法和技術，從分子結構層面分析煙堿對人胃蛋白酶空間結構及氨基酸殘基微環境的影響，探討煙堿與胃蛋白酶之間的作用機理，旨在進一步揭示口含煙煙堿在人體內的轉運過程及吸收特性，為口含煙產品開發提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse熒光分光光度計（美國Varian公司）；傅里葉變換近紅外光譜儀（Thermo Scienti fi c公司）；TU1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；400圓二色譜儀（美國AVIV公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海精宏實驗設備公司）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；PHS-3C pH 計（成都世紀方舟科技有限公司）。

胃蛋白酶（美國Sigma-Aldrich生物技術公司，純度大于99%）：用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液配成5.0×10-4mol/L的儲備液，于4℃下保存；牛血紅蛋白（美國Sigma-Aldrich生物技術公司，純度大于99%）：用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液配成0.5 wt.%的儲備液，于4℃下保存；煙堿（加拿大TRC公司，純度大于99%）：用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液配成0.249 mol/L的儲備液，于4℃下保存。無水檸檬酸、檸檬酸三鈉（二水）、三氯乙酸均為分析純；實驗用水為三次去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜測定

配置Pepsin溶液，加入不同體積的NIC溶液，用檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液定容至5mL，使Pepsin溶液濃度為4.0×10-5mol/L，NIC最終濃 度 為0、0.498、0.966、1.494、1.992、2.490、2.988×(10-3)mol/L，并在298K、303K和308K下平衡30min。設定激發波長為280 nm，掃描波長范圍為300-500 nm，激發與發射的狹縫分別為5 nm和10 nm。測定熒光壽命時，熒光激發波長為280 nm，發射波長為345 nm。同步熒光光譜掃描方法為固定Δλ（熒光發射與激發波長差）為15 nm和60 nm。三維熒光激發波長范圍為200-400 nm，間隔5 nm，發射波長范圍為200-500 nm。同步熒光、三維熒光及熒光壽命測定均室溫（298 K）下進行，所有測定均重復六次。

1.2.2 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）測定

固定Pepsin溶液最終濃度為4.0×10-5mol/L，加入NIC溶液，使其最終濃度為2.490×10-3mol/L，同時配制等摩爾濃度的空白Pepsin和空白NIC溶液。在溫度298 K，分辨率4cm-1，掃描次數64下分別掃描檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液、空白Pepsin溶液、空白NIC溶液以及Pepsin-NIC混合液的紅外光譜，測定范圍為4000-600cm-1。

1.2.3 圓二色譜（CD）測定

在室溫條件下，分別測定Pepsin和Pepsin-NIC在200-260 nm下的圓二色譜，其中Pepsin和NIC的最終濃度分別為5×10-6mol/L和2.49×10-4mol/L，所有數據均測量三次后取平均值。

1.2.4 分子對接

對接過程是由Discovery Studio 3.1完成。其中胃蛋白酶單晶模型，從蛋白數據庫（Protein Data Bank，PDB，ID:5PEP）獲得。NIC的初始結構由ChemiDraw11.0分子模擬軟件包生成后，利用Discovery Studio 3.1進行優化處理。

1.2.5 胃蛋白酶活性測定

配置Pepsin溶液，加入不同體積的NIC溶液，使Pepsin濃度為2.0×10-5mol/L，NIC最終濃度分別為0、0.498、0.966、1.494、1.992、2.490、2.988、3.486(×10-3)mol/L。將配制好的不同濃度樣品在310 K下恒溫20min，分別加入2mL的牛血紅蛋白(0.5 wt.%)，310 K下恒溫反應20min。20min后，向以上所有樣品中分別加入2mL的三氯乙酸終止反應，12000 rpm離心30min，過濾上清液，測量上清液在275 nm下的紫外吸收光譜值。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜及猝滅機理

胃蛋白酶中色氨酸殘基的存在，使其在340 nm處有最大發射峰。當藥物與胃蛋白酶結合時，會改變其內部氨基酸殘基所處的微環境，從而會引起蛋白熒光光譜的變化。因此，通過加入藥物前后蛋白熒光光譜的變化，可以初步判斷藥物與胃蛋白酶是否發生作用[6]。圖2為298K時Pepsin與不同濃度NIC相互作用時的熒光光譜圖。從圖中可看出,隨著NIC濃度的增加，Pepsin最大發射峰（在340 nm左右）強度逐漸降低，由此說明NIC與Pepsin發生了結合。

圖2 不同NIC濃度條件下Pepsin的熒光強度及加入NIC 前后的Pepsin的熒光衰減圖(CPepsin=4×10-5 mol/L；CNIC=0-2.988×10-3 mol/L(a→g)；pH=2.0；T=298K；λex=280 nm.)Fig.2 The fluorescence intensity of pepsin with different NIC concentrations at 298 K(λex=280 nm); CPepsin=4×10-5 mol L-1；CNIC=0-2.988×10-3 mol L-1(a → g)

熒光猝滅機制分為靜態猝滅和動態猝滅兩種類型[9-10]。對于靜態猝滅，處于基態的熒光分子與猝滅劑生成了不發光的復合物，導致其蛋白熒光強度改變；對于動態猝滅，處于激發態的熒光分子與猝滅劑接觸時發生碰撞，碰撞接觸后熒光分子又返回基態而引起熒光強度改變[11-12]。無論是靜態猝滅還是動態猝滅，均可以通過Stern-Volmer方程來判斷[13]：

式中F0為猝滅劑不存在時蛋白的熒光強度；F為加入猝滅劑后的熒光強度；[Q]為猝滅劑濃度；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數。

從圖3可看出，不同溫度下的Stern-Volmer曲線線性關系良好。根據擬合結果（表1）發現，隨著溫度的升高，Ksv值逐漸下降，說明NIC與Pepsin之間的熒光猝滅機制為靜態猝滅。

圖3 不同NIC濃度、不同溫度條件下Stern-Volmer線性方程圖；pH=2.0，T=298,303,308KFig.3 Stern–Volmer curves of pepsin at different temperatures.pH=2.0,T=298,303,308K

表1 NIC-pepsin體系在不同溫度下的結合常數及熱力學參數Tab.1 Binding constants of the NIC–Pepsin system at different temperatures

應用瞬態時間分辨熒光法來進一步判斷Pepsin與NIC相互作用的猝滅類型。Pepsin和Pepsin-NIC的熒光衰減圖見圖2，擬合結果見表2。據圖2可知，加入NIC并未使Pepsin的熒光衰減曲線發生明顯變化。根據公式（2），考慮誤差范圍內，加入NIC后Pepsin的平均熒光壽命＜τ＞幾乎不變（表2），由此可以說明Pepsin與NIC相互作用為靜態基態復合物的形成過程。

表2 不同NIC濃度下Pepsin的熒光壽命Tab.2 Fluorescence lifetime(τ)of pepsin at different NIC concentrations

對于靜態猝滅過程，根據下面的雙對數方程可以計算得到結合常數Ka與結合位點數n：

其中，F0為猝滅劑不存在時蛋白的熒光強度；F為加入猝滅劑后的熒光強度；[Q]為猝滅劑濃度；Ka為結合常數；n為結合位點數。根據方程（3）計算的不同溫度下Ka值以及n值列于表1。從表中結果可看出，不同溫度下的結合位點數n都約等于1，表明NIC與Pepsin之間存在著一個高親和力的結合位點。此外，不同溫度下的Ka值變化較小，表明隨著溫度升高，NIC-Pepsin復合物穩定性較好。

2.2 NIC與Pepsin相互作用力類型

藥物與蛋白之間相互作用力類型有四種，即氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力[14]，以下Vanr Ho ff方程用于計算不同溫度下的熱力學參數[15]。

不同溫度下的熱力學參數列于表1。根據生物大分子以及小分子的結合力性質和系統中熱力學參數的關系[16]可知：ΔG＜0，說明NIC與Pepsin之間的相互作用過程是一個自發過程；ΔH＜0，ΔS＜0，表明NIC與Pepsin間的相互作用過程主要由氫鍵和范德華力主導。

2.3 Pepsin構象變化

2.3.1 同步熒光光譜學研究

同步熒光法因其選擇性好，有利于單獨分析隨著藥物濃度的升高，酪氨酸（Tyr）殘基（Δλ=15 nm）和色氨酸（Trp）殘基（Δλ=60 nm）微環境的變化，因此常被用于研究蛋白構象的變化[17,18]。圖4為NIC和pepsin體系的同步熒光光譜圖。由圖可知，隨著NIC濃度增大，pepsin熒光強度都隨之降低，且Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的最大發射波長均發生了紅移，說明加入NIC使Tyr和Tpr殘基所處的微環境極性增強，這是由于疏水性減小，增加了蛋白質肽鏈的伸展程度所致[19]。

圖4 NIC與Pepsin相互作用的同步熒光光譜圖。(A)Δλ=15 nm ；(B)Δλ=60 nm；CPepsin=4×10-5 mol/L；CNIC=0-2.988×10-3 mol/L(a→g),T=298K,pH=2.0.Fig.4 The synchronous fluorescence spectra of pepsin.(A)Δλ=15 nm；(B)Δλ=60 nm；CPepsin=4×10-5 mol L-1；CNIC=0-2.988×10-3 mol L-1(a → g),T=298K,pH=2.0.

2.3.2 三維熒光光譜研究

三維熒光光譜法常用于研究蛋白構象變化，可為NIC對Pepsin構象的影響提供更多有效信息。圖5為Pepsin（A）和NIC-Pepsin（B）的三維熒光光譜圖。從圖中可看出，Pepsin最強的熒光峰在λex/λem=280/340 nm處，這是由Pepsin中芳香族氨基酸的π―π*躍遷所引起[20]。加入NIC后，Pepsin最強熒光峰遷移至λex/λem=280/344 nm處，即最強熒光峰峰位發生略微紅移。此外，加入NIC使Pepsin的最大熒光峰強度明顯降低（567→467）。這些結果表明，NIC和Pepsin之間的相互作用，使Pepsin中氨基酸殘基的微環境極性增加，進而導致Pepsin的構象變化，此結果與同步熒光光譜研究結果基本吻合。

圖5 Pepsin（A）和NIC-Pepsin（B）體系三維熒光光譜圖；CPepsin=4.0×10-5 mol/L；CNIC=2.988×10-3 mol/L.Fig.5 The 3D fluorescence spectra of Pepsin(A)and NIC-Pepsin(B).CPepsin=4.0×10-5 mol L-1；CNIC=0,2.988×10-3 mol L-1.

2.3.3 紅外光譜（FT-IR）研究

蛋白的FT-IR光譜圖主要反映蛋白分子酰胺帶振動偶極矩的變化，在藥物與蛋白結合的研究中應用較多[21]。蛋白質在中紅外區主要有NH伸縮共振（～3300cm-1），一級酰胺Ⅱ帶（～3100cm-1），酰胺Ⅰ帶的C=O伸縮振動（1700～1600cm-1），酰胺Ⅱ帶的N-H彎曲振動和C-N伸縮振動（1600～1500cm-1）[22,23]。本文利用能靈敏反應蛋白二級結構變化的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ帶來考察Pepsin的結構變化。

圖6為Pepsin的紅外光譜圖。從圖中可看出，加入NIC使Pepsin酰胺Ⅰ帶的C=O伸縮振動從1645.25cm-1紅移至1638.12cm-1；使Pepsin酰胺Ⅱ帶的N-H彎曲振動和C-N伸縮振動（1600～1500cm-1）從1541.07cm-1藍移至1548.87cm-1。此結果表明，NIC與Pepsin發生相互作用使得Pepsin多肽鏈的C=O、 C-N 和N-H發生了變化，進而改變了Pepsin的空間結構。

圖6 Pepsin（A）和Pepsin-NIC（B）體系的FT-IR譜圖Fig.6 The FT-IR spectra of Pepsin(A)and NIC-Pepsin(B).CPepsin=4.0×10-5 mol L-1；CNIC=0,2.490×10-3 mol L-1.

2.3.4 圓二色譜（CD）研究

圓二色譜法是監測蛋白二級結構變化的有用工具。由于基態和激發態之間存在著電子轉換，因此200 nm-260 nm被視為測量蛋白構象變化的有效范圍[24,25]。圖7顯示加入NIC前后Pepsin圓二色譜圖的變化。在約200 nm處Pepsin有一個很強的負峰，加入NIC前，Pepsin峰型幾乎沒有變化，說明Pepsin依然保持較高的β-折疊[15]。但是加入NIC后Pepsin圓二色譜峰強度明顯增加，說明NIC一定程度上改變了Pepsin的二級結構。

圖7 NIC對Pepsin二級結構的影響；CPepsin=5.0×10-6 mol/L；CNIC=2.49×10-4 mol/L.Fig.7 The CD spectra of Pepsin with and without NIC.CPepsin=5.0×10-6 mol L-1；CNIC=0,2.49×10-4 mol L-1

2.4 分子對接

本實驗應用Discovery Studio 3.1中的CDOCKER對接程序[26]來研究NIC與Pepsin之間的活性位點。對接之前，先將受體Pepsin進行加氫預處理，給配體分子（NIC）賦力場。在pH=2.0的條件下，選中在受體Pepsin周圍2.5? 之內的所有氨基酸，然后用CDOCKER對接。圖7顯示的是最優的對接結果。2D圖中的紫色基團代表此氨基酸基團與配體之間的作用力為氫鍵作用力，綠色基團代表此氨基酸基團與配體之間的作用力為范德華力。從圖中可看出，NIC與Pepsin中Glu13 氨基酸殘基之間的作用力為氫鍵作用力，與Thr218、Gly76、Tyr75、Ile30等氨基酸殘基之間的作用力為范德華力。對接結果與熱力學參數推測的結果相吻合。

圖8 NIC與Pepsin相互作用的分子對接圖Fig.8 Molecular docking results of pepsin with NIC

2.5 酶活性測定

根據Anson等[27]方法，利用牛血紅蛋白水解產物在275 nm下的吸光度來比較酶活性的高低。不同濃度NIC下的Pepsin活性可由下列公式計算得到[28]：

圖9為不同濃度NIC對Pepsin活性的影響，從圖中可以看出，隨著NIC濃度的增加，Pepsin的活性呈線性增加。此結果表明，當NIC進入到胃部后，對Pepsin活性呈明顯的增強效應。

圖9 不同濃度的NIC對Pepsin活性的影響；CPepsin=2.0×10-5 mol/L；CNIC=0-3.486×10-3 mol/LFig.9 The relative activity of pepsin at different NIC concentrations.CPepsin=2.0×10-5 mol L-1；CNIC=0-3.486×10-3 mol L-1.

3 結論

本文采用了熒光光譜、紅外光譜、圓二色譜等多種光譜學方法和分子模擬對接技術，研究了煙堿與胃蛋白酶之間的相互作用機理。研究方法可靠、合理，易于實現，有別于傳統卷煙煙堿攝入研究方法。光譜學與分子對接研究結果顯示：1）煙堿與胃蛋白酶的結合過程為自發進行，其主要作用力為氫鍵和范德華力，猝滅類型為靜態猝滅；2）煙堿與胃蛋白酶之間存在著一個高親和力的結合位點；3）煙堿會導致胃蛋白酶構象發生變化，同時對胃蛋白酶活性有明顯的增強效應。在pH=2.0的條件下，從分子層面上分析了煙堿對胃蛋白酶空間結構的影響，探討了煙堿與胃蛋白酶之間的作用機理，揭示了口含煙煙堿在人體胃部的轉運過程和吸收特性，為口含煙產品的開發、質量控制和安全評價工作提供了理論基礎。

在本研究的基礎上，未來還將對口含煙煙堿通過胃部吸收的滲透方式以及與人體血清蛋白相互作用等過程中的關鍵問題進行系統研究，進一步可為口含煙煙堿在人體內分布情況以及相關動力學研究提供基礎研究，為我國口含煙制品研制提供基礎數據和理論依據。

[1]Chen H,Sharp BM,Matta,SG,Wu QL(2011)Social Interaction Promotes Nicotine Self-Administration with Olfactogustatory Cues in Adolescent Rats.Neuropsychopharmacology 36:2629–2638.

[2]Viverosa MP,Marco EM,File SE(2006)Nicotine and cannabinoids:Parallels,contrasts and interactions.Neuroscience and Biobehavioral Reviews 30:1161–1181.

[3]Hughes JR,Hatsukami DK,Pickensl RW,Krahn D,Malin S,Luknic A(1984)Effect of nicotine on the tobacco with drawal syndrome .Psychopharmacology 83:82-87.

[4]Kono J,Miyata H,Ushijima S,Yanagita T,Miyasato K,Ikawa G,Hukui K(2001)Nicotine,alcohol,methamphetamine,and inhalant dependence:a comparison of clinical features with the use of a new clinical evaluation form .Alcohol 24:99 – 106.

[5]Zeng HJ,Yang R,Liang HL,Qu LB(2015)Molecular interactions of fl avonoids to pepsin:Insights from spectroscopic and molecular docking studies.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy 151:576–590.

[6]X.X.Liao,J.G.Tang,J.W.He,D.L.Yuan,B.Liang,Q.Chen,H.Li.A New Perspective on Probing the Interaction of Nicotine with Human Serum Albumin[J].Current Analytical Chemistry,12(5):450-456.

[7]Liao XX,Yuan DL,Tang JG,Yang HQ,Liang B,Cheng Q,Li H(2016)Probing into the Interaction of Nicotine and Bovine Submaxillary Mucin:NMR,Fluorescence,and FTIR Approaches.Journal of Spectroscopy 4:1-9.

[8]Kortüm G,Wilski H(1955)The mechanism of quenching of fluorescence.Transactions of the Faraday Society 51:1620-1623.

[9]Gokoglu E,Kipcak F,Seferoglu Z(2014)Studies on the interactions of 3,6-diaminoacridine derivatives with human serum albumin by fluorescence spectroscopy,Luminescence.the journal of biological and chemical luminescence 29:872-877.

[10]Zeng HJ,You J,Liang HL,Qi T,Yang R,Qu LB(2014)Investigation on the binding interaction between silybin and pepsin by spectral and molecular docking,International journal of biological macromolecules 67:105-111.

[11]Wang Q,Zhang SR,Ji X(2014)Investigation of interaction of antibacterial drug sulfamethoxazole with human serum albumin by molecular modeling and multi-spectroscopic method.Spectrochimica acta.Part A,Molecular and biomolecular spectroscopy 124:84-90.

[12]Xiao D,Zhang L,Wang Q,Lin X,Sun J,Li H(2014)Investigations of the interactions of peimine and peiminine with human serum albumin by spectroscopic methods and docking studies.Journal of Luminescence.146:218-225.

[13]Hu YJ,Liu Y,Wang JB,Xiao XH,Qu SS(2004)Study of the interaction between monoammonium glycyrrhizinate and bovine serum albumin.Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 36:915-919.

[14]Chandrasekaran S,Sameena Y,Enoch IV(2014)Tuning the binding of coumarin 6 with DNA by molecular encapsulators:e ff ect of beta-cyclodextrin and C-hexylpyrogallol[4]arene.Journal of molecular recognition 27:640-652.

[15]Zeng HJ,Yang D,Hu GZ,Yang R,Qu LB(2016)Studies on the binding of pepsin with three pyrethroid insecticides by multispectroscopic approaches and molecular docking.Journal of molecular recognition 29:476-484.

[16]Fan Y,Zhang S,Wang Q,Li J,Fan H,Shan D(2013)Investigation of the interaction of pepsin with ionic liquids by using fluorescence spectroscopy.Applied spectroscopy 67:648-655.

[17]Ying M,Huang F,Ye H,Xu H,Shen L,Huan T,Huang S,Xie J,Tian S,Hu Z,He Z,Lu J,Zhou K(2015)Study on interaction between curcumin and pepsin by spectroscopic and docking methods.International journal of biological macromolecules 79:201-208.

[18]Fan Y,Zhang S,Wang Q,Li J,Fan H,Shan D(2013)Interaction of an amino-functionalized ionic liquid with enzymes:a fluorescence spectroscopy study,Spectrochimica acta.Part A.Molecular and biomolecular spectroscopy 105:297-303.

[19]Li XR,Yang ZJ(2015)Dissection of the binding od L-ascorbic acid to trypsin and pepsin using isothermal titration calorimetry,equilibrium microdialysis and spectro fl uorimetry.RSC Advance 5:35487-35496.

[20]Zeng HJ,Qi T,Yang R,You J,Qu LB(2014)Spectroscopy and molecular docking study on the interaction behavior between nobiletin and pepsin.Journal of fluorescence 24:1031-1040.

[21]Yan J,Wang Q,Pan Q,Rao Z,Su,Li H(2013)Assessment of the interaction between fraxinellone and bovine serum albumin by optical spectroscopy and molecular modeling methods.Journal of Luminescence 137:180-185.

[22]Roy D,Dutta S,Maity SS,Ghosh S,Roy KS,Ghosh,Dasgupta S(2012)Spectroscopic and docking studies of the binding of two stereoisomeric antioxidant catechins to serum albumins.Journal of Luminescence 132:1364-1375.

[23]Li X,Ni T(2015)Binding of glutathione and melatonin to pepsin occurs via different binding mechanisms.European Biophysics Journal 45:165-174.

[24]Wu G,Robertson DH,Brooks CL,Vieth M(2003)Detailed analysis of grid-based molecular docking:A case study of CDOCKER—A CHARMm-based MD docking algorithm.Journal of computational chemistry 24:1549-1562.

[25]Vieth M,Hirst JD,Dominy BN,Daigler H,Brooks CL(1998)Assessing search strategies for flexible docking,Journal of computational chemistry 19:1623-1631.

[26]Wang Y Q,Zhang H M(2015)Exploration of binding of CI Food Red 9 with pepsin by optical spectroscopic and molecular docking methods.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy 149:822-829.

[27]Guo L,Ma X,Yan J,Xu K,Wang Q,Li H(2015)Interaction Behavior Between Niclosamide and Pepsin Determined by Spectroscopic and Docking Methods.Journal of fluorescence 25:1681-1693.

Preliminary investigation on interaction mechanism between nicotine and pepsin

HAN Jingmei1,LIAO Xiaoxiang1,LEI Ping1,YUAN Dalin1,ZHENG Xudong1,SHANG Shanzhai1,LI Zhiqiang1,TANG Jianguo1*,LI Hui2,CHEN Yongkuan1
1 Centre for R&D,China Tobacco Yunnan Industrial CO.,Ltd.,Kunming 650231,China;
2 School of Chemical Engineering,Sichuan University,Chengdu 610064,China

In order to investigate absorption characteristics of human stomach to nicotine(NIC)in tobacco products for oral use,certain concentration of citric acid and sodium citrate bu ff er solution(pH=2.0)were prepared for simulating gastric conditions and di ff erent levels of nicotine solutions were prepared by using bu ff er solution.After interaction of pepsin with di ff erent levels of nicotine,spectrum changes of the pepsin before and after addition of di ff erent levels of nicotine were observed by various spectroscopic methods i.e.fluorescence spectrum,ultraviolet spectrum,infrared spectrum,circular dichroism spectrum and molecular docking simulation technology.Action mechanism between nicotine and pepsin was studied.Research of spectroscopy and molecular docking simulation indicated that:1)the quenching mechanism of NIC on pepsin was static fluorescence; 2)NIC and pepsin interacted spontaneously via hydrogen bonding and van der Waals forces; 3)there existed a single high-affinity binding site between NIC and pepsin; 4)interaction between NIC and pepsin increased polarity of microenvironment of amino-acid residues in pepsin,and changed C=O,C-H and N-H of polypeptide chain of pepsin,resulting variation of conformation and spatial structure of pepsin.In the mean time,NIC promoted activity of pepsin when it was added into pepsin at di ff erent concentrations.Results of this research can provide references for development,quality control and health risk evaluation of tobacco products for oral use.

nicotine; pepsin; spectroscopy; molecular-docking; interaction mechanism

韓敬美，廖曉祥，雷萍，等.煙堿與胃蛋白酶相互作用機理初步研究[J].中國煙草學報，2017,23（5）

中國煙草總公司科技重大專項項目“基于外周加熱方式的電加熱新型煙草制品的研究與開發(11020151003（XX-03）)”；云南省青年自然科學基金項目“電子煙中煙堿形態分析及遷移規律研究(2015FD097)”

韓敬美（1986—），碩士研究生，研究方向：煙草化學、新型煙草制品技術研究，Email:hanjingmei@126.com

湯建國（1976—），博士研究生，研究方向：煙草化學和新型煙草制品技術研究，Email:jgtang@163.com

2017-04-26；< class="emphasis_bold">網絡出版日期：

日期：2017-09-29

：HAN Jingmei,LIAO Xiaoxiang,LEI Ping,et al.Preliminary investigation on interaction mechanism between nicotine and pepsin[J].Acta Tabacaria Sinica,2017,23(5)

*Corresponding author.Email：jgtang@163.com