利用野栽分離群體定位水稻粒型相關QTL

梁云濤，潘英華,2，徐志健

(1.廣西壯族自治區農業科學院水稻研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西水稻遺傳育種重點實驗室，廣西 南寧 530007)

利用野栽分離群體定位水稻粒型相關QTL

梁云濤1，潘英華1,2，徐志健1

(1.廣西壯族自治區農業科學院水稻研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西水稻遺傳育種重點實驗室，廣西 南寧 530007)

【目的】挖掘水稻粒型相關QTL位點可為水稻的粒型遺傳機制研究和優質化分子育種提供理論基礎?！痉椒ā恳詮V西普通野生稻高代自交系材料ZY03為父本，栽培稻品種日本晴為母本，通過常規雜交獲得包含160個單株的F2分離群體，并開展粒長、粒寬及粒長寬比等粒型性狀的調查。利用分布于水稻12條染色體上的184個SSR標記對F2群體單株進行分子檢測。應用MAPMAKER EXP 3.0軟件進行數據分析，構建分子標記連鎖圖。應用QTLmapping3.0軟件，采用復合區間作圖法(composite interval mapping，CIM)，以LOD=2.5為閾值檢測控制粒長、粒寬和粒長寬比等性狀的QTL。【結果】在F2群體中，目標性狀呈現連續變異，有明顯的雙向超親分離現象。共檢測到與粒型相關的QTL 3個，其中1個粒長QTL位于第5染色體RM405～RM548區間內，被命名為qGL5.1，表型貢獻率為10.68 %，加性效應為0.02；在第1染色體RM5501～RM486區間內檢測到1個控制粒寬的QTL，被命名為qGW1.1，表型貢獻率為10.56 %，加性效應為0.34；在第5號染色體RM405～RM548區間檢測到1個控制粒長寬比的QTL，被命名為qLWR5.1，表型貢獻率為14.77 %，加性效應為0.12。上述所有QTL的增效等位基因均來自于親本ZY03。其中，粒長QTLqGL5.1與粒長寬比QTLqLWR5.1位于同一標記區間內?！窘Y論】從野栽分離群體挖掘到3個野生稻的粒型QTL位點，定位結果可用于下一步主效QTL的精細定位和分子標記輔助選擇育種。

粒長；粒寬，粒長寬比；QTL

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是我國的第一大糧食作物。近年來，隨著我國人民生活水平的不斷提高，消費者對稻米品質的要求也越來越高，優質稻米的市場需求量逐年增加。因此，選育既高產又優質的新品種已成為當前水稻育種的趨勢。粒型是水稻重要的品質性狀，同時也是產量性狀的重要組成部分。粒型主要由谷粒的粒長、粒寬、粒厚等3個性狀構成。它們可通過協同作用調節千粒重進而影響稻谷產量。因此，改良水稻粒型是改善稻米品質和提高水稻產量的有效途徑。大多數粒型性狀屬于數量性狀，受到多基因的控制，其遺傳易受環境和遺傳背景等多種因素的影響。通過全面解析粒型相關性狀的遺傳機制和挖掘功能基因/QTL位點，可為水稻高產、優質化育種提供理論依據和優異基因資源，對推動水稻育種新突破具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近20年來，隨著分子生物學技術和現代遺傳理論的進步，極大地推動了水稻分子遺傳學的發展，從而可以在分子水平上深入解析不同性狀的遺傳機制，并發掘出大量控制水稻粒型性狀的優異基因和QTL位點。到目前為止，各國科學家已經利用RFLP、RAPD、SSR等分子標記定位了許多控制粒型的QTL或基因[1]，分別在水稻12條染色體上共檢測到控制粒型性狀的QTL252個，其中包括粒長QTL77個，粒寬QTL109個，以及粒長寬比QTL66個(http://www.gramene.org)。另外，還精細定位了GW3.1、qGL3.2、GS7、qGL7 -2和GW9.1等控制粒型的主效QTL，以及克隆了GW2[2-3]、GS2[4]、GS3[5]、GS5[6]、GW5[7-8]、GL7[9]和GL3.1[10]等7個粒型基因。這些重要的遺傳位點的發掘和利用為水稻優質化育種提供了寶貴的基因材料，有效提升了稻米品質。然而，目前主要是以栽培稻為研究對象，粒型基因來源過于單一。野生稻長期生長在自然環境中，未受到人為選擇干擾，保留了大量栽培稻已喪失的優質基因資源，是重要的水稻基因寶庫。長期以來，絕大部分被挖掘到的基因/QTL均來自于栽培稻。如何更充分地發掘和利用野生稻基因已成為當前一個熱點研究方向?！颈狙芯壳腥朦c】野生稻基因的發掘和利用可為水稻育種提供優良的基因資源，能進一步拓寬水稻親本的遺傳基礎，加快實現水稻育種的新突破?！緮M解決的關鍵問題】本研究將ZY03和日本晴作為親本配組雜交，構建F2分離群體，然后利用分子標記技術開展水稻粒型的QTL檢測分析，旨在挖掘出控制粒型的野生稻優異基因QTL位點，并從基因組水平上揭示其遺傳機制，為下一步的粒型主效QTL精細定位及稻米外觀品質分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將1份廣西普通野生稻連續進行10個世代的嚴格套袋自交，從而獲得遺傳穩定的野生稻自交系材料，其中編號為ZY03的自交系材料谷粒細長、田間綜合表現優秀，是優良的水稻育種中間材料。試驗以栽培稻品種日本晴作為母本，野生稻自交系ZY03作為父本，通過配組雜交獲得F1代，然后進行繁殖加代，獲得160個F2代單株，構成作圖群體。所有試驗均在廣西壯族自治區農業科學院水稻研究所試驗基地完成。

1.2 水稻粒型性狀評價

于2015年夏季在廣西農科院水稻研究所試驗田種植親本日本晴和ZY03及160個F2代單株。株行距為20 cm×23 cm，常規水肥管理。成熟后分別采收親本和F2群體單株主穗，自然曬干，然后從主穗挑選所有飽滿谷粒進行考種，取其平均值為表型值。稻谷粒型(粒長、粒寬和長寬比)的測定參照Tan等[11]的方法進行。

1.3 DNA提取及分子標記檢測

在水稻分蘗期對F2群體中的單株進行掛牌取樣，每個單株取2片葉子裝入封口朔料袋，放置在-20 ℃冰箱里備用。DNA提取方法在參考Murray等[12]方法的基礎上略有改動。

參照McCouch等[13]公布的SSR標記信息，從中挑選出均勻分布在水稻12條染色體的600對SSR標記，由北京華大生物技術服務有限公司合成標記引物。從F2群體中分別挑選出粒型性狀極大和極小的各10個單株，提取其基因組DNA，分別混合建立高低池。用高低池對600對SSR標記進行多態性分析，從中篩選出184個具有多態的分子標記。然后，利用184個多態標記對F2分離群體進行分子分析，檢測目標性狀QTL。

分子標記PCR反應體系為10 μl體系，包含模板1 μl(50 ng·μl-1)，引物1 μl(30 ng·μl-1)，2×TaqMasterMix(含染料)4 μl，ddH2O 4 μl。擴增程序為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共35個循環，然后72 ℃下終延伸10 min，待溫度降到10 ℃后取出，放置4 ℃冰箱內備用。擴增結果采用6 %聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測。PCR擴增程序、凝膠電泳和銀染均參照Panaud等[14]方法。

1.4 QTL檢測分析

利用分布于水稻12條染色體上的184個SSR標記對F2群體進行分子檢測，應用 MAPMAKER EXP 3.0軟件分析實驗數據，構建分子標記連鎖圖譜；然后應用QTL mapping3.0軟件進行QTL分析，結合表型值，采用復合區間作圖法(Composite interval mapping，CIM)、以LOD=2.5為閾值檢測 QTL。并計算每個QTL的表型貢獻率。QTL命名原則遵循McCouch等[15]方法。采用 Excel軟件對群體的性狀表型值進行統計分析。

1.5 QTL連鎖標記表型效應分析

將QTL連鎖標記的日本晴等位基因記為A基因型，ZY03等位基因記為B基因型。從F2群體中挑選出標記基因型為AA和BB的單株，應用SPSS12.0軟件分別統計AA基因型和BB基因型單株群體的目標性狀表型平均值，并分析兩群體表型平均值的差異程度。

2 結果與分析

2.1 親本與F2群體的粒型表現

2親本的粒長、粒寬、粒長寬比等性狀表現差異較大。親本日本晴與ZY03的粒長分別為0.66 cm和0.95 cm(圖1、表1)，親本之間粒長差異達到極顯著水平(P≤0.01)。F2群體中的粒長呈現正態分布，粒長分布范圍為0.69～0.98 cm，變異系數為6.3 %，群體出現連續變異，出現明顯的雙向超親分離，且存在個別超親粒長現象。親本日本晴與ZY03的粒寬分別為0.27和0.22cm(圖1,表1)，親本之間粒寬差異達到顯著水平(P≤0.05)。F2群體中的粒寬呈現正態分布，粒寬分布范圍為0.28 ～0.38 cm，變異系數為5.2 %，群體出現連續變異，出現明顯的雙向超親分離，且存在超親粒寬現象。親本日本晴與ZY03的粒長寬比分別為2.5和4.1(圖1～4，表1)，親本長寬比之間差異達到極顯著水平(P≤0.01)。F2群體中的長寬比呈現正態分布，長寬比分布范圍為2.0～3.1，變異系數為8.9 %，群體出現連續變異，出現明顯的雙向超親分離，且存在個別超親長寬比現象。統計分析顯示，粒型性狀在群體上均呈正態連續分布，可以推測粒長、粒寬和粒長寬比等3種性狀均屬多基因控制的數量性狀(圖1～4)。

圖1 日本晴與ZY03的粒型差別Fig.1 Difference of grain shape between Nipponbare and ZY03

圖2 F2群體中粒長的頻度分布Fig.2 The frequency distribution of grain length of F2 population

2.2 粒型性狀之間的相關性

相關性分析表明，粒長與粒寬之間相關系數為-0.13，兩者間的相關性不顯著；而粒長與粒長寬比之間相關系數為0.8，兩者具有高度正相關；粒寬與粒長寬比之間相關系數為-0.7，兩者具有顯著負相關(表2)。結果顯示，粒寬與粒長寬比之間，以及粒長和粒長寬比之間均存在顯著的相關性；而粒長和粒寬相關性不顯著。由此可以推測，控制粒寬和粒長分別與控制粒長寬比的遺傳調控機制之間相互緊密關聯，而控制粒寬與粒長的調控機制則相對獨立。

表1 親本及其F2群體粒型相關性狀表現

注：**為極顯著差異。

Noe:**indicate the significance at the probability levels of 0.01.

圖3 F2群體中粒寬的頻度分布Fig.3 The frequency distribution of grain width of F2 population

2.3 粒型QTL分析

試驗共檢測到與粒型相關的QTL 3個。其中1個粒長QTL位于5號染色體RM405～RM548區間內，LOD值為2.53，單個QTL對表型的貢獻率為10.68 %，加性效應為0.02，被命名為qGL5.1；1個粒寬QTL位于1號染色體RM5501～RM486區間內，LOD值為2.54，單個QTL對表型的貢獻率為10.56 %，加性效應為0.34，被命名為qGW1.1；1個控制粒長寬比的QTL位于5號染色體RM405～RM548區間內，LOD值為3.0，單個QTL對表型的貢獻率為14.77 %，加性效應為0.12，命名為qLWR5.1(表3、圖5)。其中，粒長QTLqGL5.1與粒長寬比QTLqLWR5.1位于同一個區間內。上述QTL的增效等位基因均來源于親本Y03，表明來自野生稻的等位基因將會引起粒長、粒寬和粒長寬比等性狀值的增加。

圖4 F2群體中粒長寬比的頻度分布Fig.4 The frequency distribution of length-width ratio of grain of F2 population

2.4 qGL5.1連鎖標記表型效應分析

與qGL5.1緊密連鎖的分子標記有RM405和RM548標記。RM405標記AA基因型的粒長平均值為0.80 cm，BB基因型的粒長平均值為0.86 cm，BB基因型的平均粒長比AA基因型的粒長長7.50 %，未達到顯著差異；RM548標記AA基因型的粒長平均值為0.80 cm，BB基因型的粒長平均值為0.86 cm，BB基因型的平均粒長比AA基因型長7.50 %，達到顯著差異(表4)。

2.5 qLWR5.1連鎖標記表型效應分析

與qLWR5.1緊密連鎖的分子標記是RM405和RM548標記。RM405標記的AA基因型的粒長寬比平均值為2.36，BB基因型的粒長寬比平均值為2.61，BB基因型比AA基因型長了10.60 %，差異達到極顯著。RM548標記AA基因型的粒長寬比平均值為2.37，BB基因型的粒長寬比平均值為2.62，兩者相差10.54 %，差異達到極顯著(表4)。

表2 粒型性狀之間的相關性

注：*為顯著差異。

Note:*indicate the significance of correlation at the probability levels of 0.05.

表3 粒型性狀的QTL及其遺傳效應

注： 1)加性效應；2)顯性效應。

Note:1) Additive gene effect;2) Dominance gene effect.

表4 單標記效應分析

注：A:日本晴基因型，B：ZY03基因型，*為顯著差異，**為極顯著差異。

Note:A：Genotype of Japonica, B:Genotype of ZY03,*and** indicate the significance of at the probability levels of 0.05 and 0.01, respectively.

圖5 粒型QTL在染色體上的分布Fig.5 The distribution of QTLs of grain shape trait on chromosomes

3 討 論

水稻粒型性狀是水稻重要的外觀品質，包括粒長、粒寬、粒長寬比、粒厚等性狀，這些粒型性狀通過影響粒重對水稻產量有很大影響[16]，并且粒型與稻米的外觀、加工品質，蒸煮后的口感都有著十分密切的關系[17]。

由于稻米粒型對于水稻產量和品質的重要性，各國科學家已經做了大量工作，深入研究影響粒型性狀的各種遺傳因素，挖掘控制粒型的基因和QTL用于育種改良。例如，張亞東等[18]利用特大粒粳稻TD70和秈稻Kasalath構建了作圖群體，定位了控制粒長的QTL5個，控制粒寬的QTL6個。汪欲鵬等[19]以大粒型水稻材料lg1與9311雜交衍生的F2遺傳分離群體為對象，在3種情況下定位到5個粒長QTL和9個粒寬QTL。趙芳明等[20]利用單片段代換系(SSSL)和雙片段代換系，共檢測到9個水稻粒型性狀QTL。鄒德堂等[21]利用兩個粳稻品種構建了F2∶3和BC2F2群體檢測到了與粒長QTL15個，與粒寬QTL8個，籽粒長寬比QTL11個。Hu等[22]構建重組自交系，定位了7 個影響粒長和 6個影響粒寬的 QTL。Zeng等[23]利用熱帶粳稻Lemont和秈稻揚稻4號構建了作圖群體，定位了4個控制谷粒長的QTL。Sun等[24]利用珍汕97和SLG組配了重組自交系群體，定位了2個控制粒型的QTL。Zhao等[25]用秈粳交后代的染色體片段滲入系構建了F3群體，定位了3個粒型相關主效QTL。隨后，在初步定位的基礎上，可通過構建重組自交系等更大的分離群體進一步精細定位粒型基因或主效QTL。Shao 等[9]利用爪哇稻D50與秈稻HB277配制了重組自交系，將控制谷粒長的QTLqGL7-2定位在7號染色體278 kb區間內。Zhang等[4]將控制大粒的基因GS2定位在2號染色體上標記GL2-35-1和GL2-12之間33.2 kb區間內。Fan等[5]則利用川7/明恢63構建回交群體進一步將粒型基因GS3精細定位在7.9 kb 區間范圍內。另外，經過多年努力，至今已成功克隆了多個控制粒型的基因和主效QTL。并通過對遺傳結構和功能的系統分析，人們可以更清晰和全面地了解它們的遺傳規律和調控機制，為水稻優質化育種提供重要的理論依據。研究發現，已克隆的粒型基因GW2包含8個外顯子，編碼一個環型E3泛素連接酶，通過將其底物錨定到蛋白酶體進行降解，從而負調節細胞的分裂，顯著地增加粒寬和千粒重，從而增加單株產量，該等位基因同時也能增加每株穗數、延長生育期，并顯著地降低每穗粒數和主穗長度，表明GW2具有明顯的一因多效[2-3]。粒型基因GW5編碼一個核定位蛋白，GW5功能的缺失將不能將泛素轉移到靶蛋白上，因而使得本應降解的底物不能被特異識別，進而激活穎花外殼細胞的分裂，增加穎花外殼的寬度，最終導致谷殼的寬度、粒重以及產量的增加[7-8]。GS5是同時影響粒寬和粒重的主效QTL，編碼一個絲氨酸縮肽酶，啟動子區域調控GS5的表達量，從而控制粒寬[6]。GW8基因通過調控細胞周期基因CDKA1、CYCD3 和E2F2的表達來影響穎殼細胞數目，最終正調控粒寬和粒重[26]。本研究分別在第1、5染色體上檢測到的3個粒長、粒寬和粒長寬比QTL，其中，qGL5.1、qLWR5.1的定位區間被發現與GS5重疊，但由于定位的區間比較大，尚不能明確qGL5.1、qLWR5.1是否與GS5等位。仍需要開展進一步的工作，構建更大的分離群體，通過加大檢測標記的密度，對其精細定位后才能確定與已知基因/QTL位點的關系。

本研究利用廣西野生稻資源，通過采取分子標記技術，挖掘到3個野生稻的粒型QTL位點。基因載體ZY03是野生稻通過多代自交和選擇而獲得野生稻自交系材料，具有遺傳穩定、綜合農藝性狀優秀等特點，是優良的育種中間材料。QTL的檢測分析從分子水平上更準確的闡明了ZY03的粒型遺傳機制，為下一步稻米品質的育種改良提供重要的理論依據，縮短了育種周期，加快了野生稻優異基因資源利用的步伐。

在本研究中，還通過對QTL連鎖標記的表型效應分析，期望能獲得可以應用于分子育種的分子標記。結果發現，在F2分離群體中，與qGL5.1連鎖的分子標記RM548，以及與qLWR5.1連鎖的標記RM405和RM548，它們ZY03等位基因型(AA)植株的谷粒長和谷粒長寬比平均值明顯高于日本晴(BB)，說明上述標記與目標性狀緊密連鎖，可以在今后水稻分子育種實踐中作為指示標記改良水稻粒型性狀。

4 結 論

本研究利用野栽雜交的F2分離群體，采用分子標記技術，共挖掘到來源于野生稻的粒型QTL 3個，1個粒長QTL位于5號染色體RM405～RM548區間內，被命名為qGL5.1；1個粒寬QTL位于1號染色體RM5501～RM486區間內，被命名為qGW1.1；1個控制粒長寬比的QTL位于5號染色體RM405～RM548區間內，被命名為qLWR5.1。所有QTL的增效等位基因均來源于親本野生稻自交系ZY03。其中，粒長QTLqGL5.1與粒長寬比QTLqLWR5.1位于同一個染色體區間。本研究的定位結果可為下一步主效QTL的精細定位和分子標記輔助選擇育種奠定了基礎。

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QTLsMappingofGrainShapeofRicebyUsingOffspringDerivedfromCrossofOryzarufipogonGriff.andCultivatedRice

LIANG Yun-tao1，PAN Ying-hua1,2, XU Zhi-jian1

(1. Rice Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007,China;2. Guangxi Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding, Guangxi Nanning 530007,China)

【Objective】Grain shape is an important trait affecting grain quality of rice and one of key factors determining the thousand seed weight and production of rice. Mining QTL loci associating with grain shape could provide theoretic basis for research on genetic mechanism of grain shape and molecular breeding for improving grain quality of rice.【Method】We constructed F2population with 160 plants derived from a cross of an inbred line ofOryzarufipogonGriff. ZY03 and Nipponbare. Grain length, grain width and length-width ratio of grain of F2plants were surveyed. 184 polymorphic SSR makers distributing on 12 chromosomes were used for mapping QTLs of grain length, grain width and length-width ratio of grain. QTL analysis was carried out by using both MAPMAKER EXP 3.0 and QTLmapping3.0. The QTLs was determined as value of LOD was 2.5.【Result】Phenotypic value of grain shape trait of F2plants showed continuous variation and strong transgressive segregation. Three QTLs associating with grain length, grain width and length-width ratio of grain were detected. These QTLs were distributed on the chromosome 1,5. Two QTLs, namelyqGL5.1 andqLWR5.1, were distributed on the chromosome 5.One QTL, namelyqGW1.1, was located on the chromosome 1.qGL5.1 controlling grain length was mapped in the marker interval RM405-RM548 on the chromosome 5, which explained 10.68 % of the total phenotypic variation.qLWR5.1 controlling length-width ratio of grain was located in the marker interval RM405-RM548 on the chromosome 5, which explained 14.77 % of the total phenotypic variation.qGW1.1 controlling length-width ratio of grain was mapped in the marker intervalRM5501-RM486 on chromosome 1,which explained 10.56 % of the total phenotypic variation.qGL5.1 andqLWR5.1 were mapped in the same marker interval on chromosome 5.Alleles of all QTLs were derived from ZY03.【Conclusion】By applying molecular marker, three wild rice QTLs were detected in F2population derived from cross of wild rice and cultivated rice. Molecular genetic mechanism controlling grain shape of rice was illuminated in this work，which would be helpful for fine mapping of major QTLs and molecular breeding in the furture.

Grain length; Grain width;Length-width ratio of grain; QTL

1001-4829(2017)10-2161-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.001

2017-07-03

廣西壯族自治區主席科技資金項目“野生稻優異基因的挖掘和利用研究”(1517-03)；國家科技資源共享服務平臺項目“國家野生稻種質資源平臺(南寧)”(NICGR2017-039)；廣西農業科學院基本科研業務專項(優勢學科團隊項目)“野生稻資源保護與利用研究”(2015YT14)；廣西農業科學院基本科研業務專項(廣西藥用野生稻基因MKK3的功能驗證(桂農科2017YZ08),廣西野生稻等保護點目標物種居群多樣性分析”(2015JZ12403),野生稻抗逆基因挖掘[2015JZ24])

梁云濤(1975-)，壯族，男，廣西崇左人，碩士，副研究員，主要從事野生稻種質資源研究，E-mail：liangyt@sina.com。

S511

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(責任編輯 陳 格)