蘭花磷酸肌醇特異性磷脂酶C基因家族生物信息學分析

胡廣隆，陳亞娟，魏建華,王宏芝，張杰偉

(北京市農林科學院 農業基因資源與生物技術北京市重點實驗室，北京 100097)

蘭花磷酸肌醇特異性磷脂酶C基因家族生物信息學分析

胡廣隆，陳亞娟，魏建華,王宏芝*，張杰偉*

(北京市農林科學院 農業基因資源與生物技術北京市重點實驗室，北京 100097)

【目的】為研究蘭花(Phalaenopsisequestris)中PI-PLC基因家族各成員在蘭花中的生理功能。【方法】利用蘭花基因組數據庫，經過生物信息學分析，獲得蘭花PI-PLC基因家族成員的基因結構、染色體定位和編碼蛋白，經過多重序列比對進行進化和分類分析。【結果】結果表明：蘭花基因組中含有3個PI-PLC家族基因成員，分別含有9～13個外顯子。TMHMM跨膜區結構分析顯示，蘭花PI-PLC蛋白均不含有跨膜區；MEME保守結構域分析顯示，蘭花PI-PLC 蛋白均含有4個保守的EF、X、Y和C2結構域。【結論】以上結果對解析蘭花PI-PLC蛋白的生物學功能提供重要的線索。

磷酸肌醇特異性磷脂酶C; 蘭花; 基因家族; 進化分析

【研究意義】磷酸肌醇特異性磷脂酶C(phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC)是一類能特異性水解4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)的磷脂酶，在其催化下，生成兩個信號轉導中重要的第二信使——1,2-二酰甘油(DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)[1-2]。最新的研究表明：在植物細胞中，脂溶性DAG停留在細胞膜上，在二酰甘油激酶的作用下生成磷脂酸(phosphatidic acid, PA)，PA與特定的蛋白激酶、脂激酶和NADPH氧化酶等蛋白相互作用[3]；而水溶性IP3進入細胞質，在一系列磷酸激酶的作用下可以快速轉化為IP4、IP5，最終轉化為IP6, 促進細胞內鈣庫中Ca2+內流，從而調節Ca2+濃度及Ca2+依賴的酶類或Ca2+依賴的通道[1-2]；進而調節植物生長發育、非生物脅迫和細胞死亡等生理過程[1-3]。【前人研究進展】高等植物中，擬南芥PI-PLC蛋白生物功能解析較為清晰。擬南芥PI-PLC基因家族有9個成員[4-5]。其中擬南芥AtPLC1(At5g58670)在不依賴ABA的高滲脅迫中發揮著重要作用[6]；擬南芥AtPLC2(At3g08510)在生長素調節的雌雄配子體的發育中發揮著重要作用[7]；擬南芥AtPLC3(At4g38530)和AtPLC9(At3g47220)在植株耐熱性方面發揮著重要作用[1,8]，在擬南芥中過量表達擬南芥AtPLC5(At5g58690)引起擬南芥葉片早衰，在煙草中過量表達擬南芥AtPLC5(At5g58690)引起煙草點狀死亡[9]。【本研究切入點】蘭科是被子植物門中第三大科，其具有重要的商品特性。2014年11月24日小蘭嶼蝴蝶蘭[Phalaenopsisequestris(Schauer) Rchb.f.]的全基因組以封面文章的形式在Nature Genetics雜志公開發表[10]，為后續利用生物信息學分析和鑒定蘭花基因組奠定了序列基礎。【擬解決的關鍵問題】本研究充分利用蘭花基因組數據庫，著重分析蘭花PI-PLC基因家族成員的基因結構、染色體定位和編碼蛋白、跨膜區結構特性及編碼蛋白保守結構域，為克隆蘭花PI-PLC基因(PePLC)提供重要的序列信息，為深入研究PePLC 蛋白的功能奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 蘭花PI-PLC基因家族全基因組、cDNA和蛋白序列的獲得

擬南芥(Arabidopsisthaliana)PI-PLC基因及蛋白序列下載自TAIR數據庫(http://www.arabidopsis.org)，水稻(OryzasativaL. spp.Japonicacv.Nipponbare)PI-PLC基因及蛋白序列下載自RAP數據庫(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)，蘭花(P.equestris)PI-PLC基因及蛋白序列均下載自P. equestris Genome數據庫(http://orchidbase.itps.ncku.edu.tw/est/P_Equestris_Genome.aspx)。

以水稻(O.sativa)PI-PLC基因家族蛋白質序列OsPLC1(Os07g49330)、OsPLC2 (Os03g18010)、OsPLC3(Os12g37560)和OsPLC4 (Os05g03610)為參比序列，利用蘭花P. equestris Genome數據庫分別進行BlastP檢索，檢索結果的全序列E值大于e-8的舍去，再利用NCBI提供的在線CDS 軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)預測這些蛋白有無PI-PLC 結構域，存在PI-PLC 結構域的蛋白序列屬于PI-PLC基因家族。

1.2 蘭花PI-PLC基因家族結構分析

利用P.equestrisGenome數據庫，獲取蘭花(P.equestris)中PI-PLC基因家族成員的基因注釋，根據各成員的內含子和外顯子的大小和數目，用手繪制其各自基因結構示意圖。

1.3 蘭花PI-PLC基因家族二級結構及跨膜區結構預測

利用在線Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)工具對PI-PLC 基因家族各成員編碼蛋白的氨基酸相似性進行分析[11]，利用在線二級結構預測軟件SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對蘭花(P.equestris)PI-PLC蛋白的α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲等二級結構進行分析[12]。利用在線軟件TMHMM Server v. 2. 0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對蘭花(P.equestris)PI-PLC蛋白的跨膜區結構進行預測分析[13]。

1.4 蘭花PI-PLC基因家族保守結構域分析

應用在線軟件MEME(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)對擬南芥、水稻和蘭花(P.equestris)PI-PLC蛋白的保守結構域進行分析[14]。

1.5 蘭花PI-PLC蛋白三級結構預測

應用在線三級結構預測軟件Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/) ，選取其自動建模功能對蘭花(P.equestris)PI-PLC蛋白質的空間結構模型進行同源建模分析[15]。

1.6 蘭花PI-PLC蛋白系統進化樹的構建

通過Clustal X(2.0)[16]軟件對擬南芥、水稻和蘭花(P.equestris)的PI-PLC蛋白進行多重序列比對分析，使用MEGA 6.0[17]軟件將序列比對結果采用Neighborjoining法(bootstrap值設為1000)生成PI-PLC蛋白的系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 蘭花PI-PLC 基因家族成員的鑒定和命名

根據水稻中已經鑒別出來的4個PI-PLC蛋白序列，分別利用P.equestrisGenome數據庫提供的Blast 程序中進行BlastP，得到8個蘭花(P.equestris)候選PI-PLC基因。利用保守域在線預測軟件CDS進行驗證PI-PLC保守結構域的存在，初步確定了蘭花(P.equestris)中含有3個PI-PLC基因。根據蘭花(P.equestris)PI-PLC基因在染色體上的定位分別命名為PePLC1-3，其分別含有9～13個外顯子(圖1)，各成員的開放閱讀框長度、氨基酸長度、染色體定位和外顯子個數等詳細信息見表1。

2.2 蘭花PI-PLC 基因家族結構分析

利用在線Clustal Omega對PI-PLC基因家族各成員編碼蛋白的氨基酸相似性進行分析，分析表明，蘭花PePLC1蛋白和PePLC3蛋白相似性最高，為70.07 %，蘭花PePLC2蛋白和PePLC3蛋白相似性最低，為59.52 %(表2)。利用在線二級結構預測軟件SOPMA 對蘭花PI-PLC基因家族各成員編碼蛋白的二級結構進行分析。分析表明：蘭花PI-PLC蛋白中無規則卷曲的比例最高(33.81 %～37.50 %)，其次為α-螺旋(30.48 %～33.39 %)，再次為β-折疊(20.16 %～23.02 %)，β-轉角最低(9.53 %～12.70 %)(表3)。利用在線軟件TMHMM Server v. 2. 0對蘭花PI-PLC蛋白的跨膜區結構進行分析，結果顯示：蘭花PI-PLC蛋白均不含有跨膜區(圖2)。

表1 蘭花PI-PLC基因家族的基本特征

圖1 蘭花PI-PLC基因家族結構分析Fig.1 Gene structure of the orchid PI-PLC gene family

使用在線保守結構域預測軟件MEME 對擬南芥、水稻和蘭花PI-PLC基因家族保守結構域進行分析，結果表明擬南芥、水稻和蘭花PI-PLC基因家族包含4個保守結構域。其中，基序1為EF結構域，相似度為8.0e-594；基序2和基序3 分別是X 和Y結構域(共同組成PI-PLC蛋白催化結構域)，相似度為分別為5.7e-509和3.9e-348；基序4為C2結構域，相似度為3.2e-371(圖3)。無論在單子葉植物水稻和蘭花中，還是在雙子葉植物擬南芥中，PI-PLC基因家族均含有EF、X、Y和C2 4個結構域，這表明PI-PLC蛋白在進化過程中存在高度保守的結構域(圖3)。

圖2 蘭花PI-PLC蛋白跨膜結構預測Fig.2 Prediction of transmembrane structure of PI-PLC proteins in Orchid

PI-PLC家族PePLC2PePLC3PePLC165.2970.07PePLC259.52

表3 蘭花PI-PLC蛋白的二級結構信息

圖3 擬南芥、水稻和蘭花的PI-PLC家族基因編碼蛋白保守結構域分布Fig.3 Distribution of conserved motifs in Arabidopsis, rice and orchid PI-PLC proteins

圖4 蘭花3條PI-PLC蛋白質三級結構Fig.4 Tertiary structure of 3 orchid PI-PLC proteins

蛋白質三級結構是在二級結構的基礎上借助各種次級鍵卷曲折疊成特定的球狀分子結構的構象，本研究采用Swiss-Model對蘭花PI-PLC蛋白進行同源建模，圖4表明：蘭花PI-PLC蛋白最終形成的三級結構在空間結構非常相似，然而無規則卷曲的比例最高，暗示不同蘭花PI-PLC蛋白在生物學功能上存在很高的保守性，不過特定的PI-PLC蛋白在特定的環境及時空中又具有各自的特異性。

2.3 蘭花PI-PLC 家族蛋白相似性和系統進化分析

利用進化樹分析軟件MEGA 6.0 對9個擬南芥PI-PLC蛋白、4個水稻PI-PLC蛋白、3個蘭花PI-PLC蛋白序列進行系統進化分析。結果顯示：這16

個PI-PLC蛋白并沒有完全按照物種聚類在一起，而是混合分布在一起。PI-PLC蛋白系統進化樹基本上按照單子葉植物和雙子葉植物聚類在一起，推測PI-PLC蛋白在單子葉植物和雙子葉植物中具有各自特異的生物學功能，暗示PI-PLC蛋白在植物進化過程中可能具有不同的進化過程。水稻OsPLC4與擬南芥AtPLC1(At5g58670)和AtPLC3(At4g38530)聚類在一起，暗示水稻OsPLC4可能具有與雙子葉植物擬南芥AtPLC1(At5g58670)和AtPLC3(At4g38530)相似的進化過程和生物學功能(圖5)。蘭花PePLC1～3和水稻的OsPLC1～3聚類在一起，暗示他們具有相似的生物學功能(圖5)。

圖5 擬南芥、水稻和蘭花的PI-PLC蛋白系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree for Arabidopsis, rice and orchid PI-PLC proteins

3 討 論

PI-PLC是磷酸肌醇信號轉導途徑中的一類關鍵水解酶，研究表明：植物PI-PLC參與了生物脅迫、非生物脅迫、調節細胞骨架等多個生理過程[1-9,18-20]。隨著分子生物學技術的不斷發展，PI-PLC基因家族已經陸續在擬南芥[4]、水稻[5]、番茄[21]中鑒定，但蘭花PI-PLC基因家族尚未鑒定。本研究鑒定蘭花PI-PLC基因家族含有3個成員，而已鑒定的擬南芥、水稻和番茄PI-PLC基因家族分別含有9個、4個和6個成員，這說明在進化過程中，PI-PLC基因可能經歷了不斷發生譜系的特異擴張和拷貝丟失。蘭花PI-PLC基因家族的3個成員分別含有9～13個外顯子，均不含有跨膜區，均含有EF、X、Y和C2 4個結構域，這表明不同物種PI-PLC基因家族中重要結構域的高度保守性。推測他們在植物諸多生理過程中發揮相似的作用。而不同物種中含有的成員數目各不相同，推測他們在特定的時空和組織響應不同的刺激從而精細調節各生理過程。

進化分析表明，蘭花PePLC1～3和水稻的OsPLC1～3聚類在一起，暗示他們可能具有相似的生物學功能(圖5)。其中蘭花PePLC1、PePLC2和水稻OsPLC1、OsPLC2，蘭花PePLC3和OsPLC3同源性較高。與水稻OsPLC2同源性最高的秈稻OsIPI-PLC1(OryzasativaL. Spp.indicaS.Katocv.yuanfengzao)參與了水稻抗病的信號轉導過程[22]，水稻OsPLC2和OsPLC3均被證明具有典型的PI-PLC生物學功能，且均定位于質膜上，OsPLC3正向調節水稻的耐鹽性[23]。據此推測蘭花PePLC1和PePLC2可能參與蘭花的抗病過程，PePLC3可能參與蘭花的耐鹽過程。

蘭花PePLC1和PePLC2、水稻OsPLC1和OsPLC2、擬南芥AtPLC1(At5g58670)和AtPLC3(At4g38530)、AtPLC2(At3g08510)和AtPLC7(At3g55940)、AtPLC8(At3g47290)和AtPLC9(At3g47220)高度同源(圖5)，研究表明：AtPLC1(At5g58670)響應了干旱、鹽脅迫、低溫脅迫[24]和ABA的次級信號轉導[25]。AtPLC3(At4g38530)不僅參與了擬南芥的開花過程，而且參與了擬南芥的耐熱反應[1,8]。表明聚類在一起的同源基因可能具有不同的生物學功能，因此不能簡單推測PePLC1和PePLC2參與蘭花的抗病過程。蘭花PePLC各成員特定的生物學功能還需要從蘭花中克隆后逐一解析其功能。

4 結 論

蘭花基因組中鑒定出3個PI-PLC家族基因成員，含有9～13個外顯子。蘭花PePLCs蛋白均不含跨膜區、均含有4個高度保守的(EF、X、Y和C2)結構域。

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BioinformaticsAnalysisofPhosphoinositide-specificPhospholipaseCGeneFamilyinOrchid[Phalaenopsisequestris(Schauer)Rchb.f.]

HU Guang-long, CHEN Ya-juan, WEI Jian-hua, WANG Hong-zhi*, ZHANG Jie-wei*

(Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing Key Laboratory of Agricultural Genetic Resources and Biotechnology, Beijing 100097, China)

【Objective】The study aims to study the function ofPhalaenopsisequestrisPI-PLCgene family members in Orchid. 【Method】On the basis of orchid genome database and bioinformatics analysis, we obtained orchidPI-PLCgene family structure and their positions on chromosome and duplication information. 【Result】The results showed that 3PePLCgenes existed in the orchid genome, contained 9-13 extrons. TMHMM results showed that all PePLC proteins don’t contain transmembrane structure. Multiple alignment and motif display results indicated that all PePLC proteins contain four conserved domains (EF, X, Y and C2). 【Conclusion】The results would provide the important clues for functional studies of orchid PI-PLC proteins.

PI-PLC;Phalaenopsisequestris; Gene family; Phylogeny analysis

1001-4829(2017)10-2218-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.010

2016-12-29

北京市科技計劃(Z171100001517011)；北京市農林科學院青年科研基金項目(QNJJ201416)；北京市農林科學院科技創新能力建設專項(KJCX20170203)

胡廣隆(1981-)，男，助理研究員，研究方向為分子生物學，E-mail：532476467@qq.com，*為通訊作者：王宏芝，副研究員，研究方向為林木分子生物學，E-mail：wanghongzhi@baafs.net.cn，張杰偉，副研究員，研究方向為植物抗逆生理與分子生物學，E-mail：jwzhang919@163.com。

S682.31

A

(責任編輯 李 潔)