一種預測土壤中煙草黑脛病發病潛力的方法

方敦煌，肖炳光，童治軍，曾建敏

(云南省煙草農業科學研究院，云南 昆明 650031)

一種預測土壤中煙草黑脛病發病潛力的方法

方敦煌，肖炳光，童治軍，曾建敏

(云南省煙草農業科學研究院，云南 昆明 650031)

【目的】了解土壤帶菌量、預測土壤黑脛病發病潛力，可為病害的精準防控、田間病圃的高效選擇、不同抗性品種的科學布局提供依據。【方法】采用土壤稀釋平板計數法、土壤假植病害調查2種方法預測土壤中煙草黑脛病的發病潛力，田間病害系統調查驗證。【結果】土壤帶菌量與病害的發生率密切相關，病原菌含量越高，發病越重、蔓延越快；隨著時間的推移，初始發病率高，最終病害發生越嚴重，最終發病率是初始發病率的10～20倍；土壤帶菌普遍存在，在所采集的土壤中均可分離獲得，病原菌含量積累到一定程度就引發病害，1000個/g土壤帶菌量為病害經濟閾值，3～5次的假植病害調查可以準確地預測土壤煙草黑脛病的發病潛力。【結論】1000個/g土壤帶菌量為煙草黑脛病的經濟閾值，據此可以對土壤的病菌進行預警；假植病害調查可以準確地預測土壤煙草黑脛病的發病潛力，表明建立在環境—寄主—病原三角關系的假植預測病害方法是一種相對準確、低成本、簡便易推廣的病害預測方法。

煙草疫霉；土壤稀釋平板計數法；土壤假植；病害調查；病害預測

【研究意義】煙草黑脛病是煙草疫霉(Phytophthoranicotianae) 引起的土傳病害，自然條件下，以菌絲體、卵孢子及厚垣孢子在土壤中的植株殘體上越冬[1]。集約化育苗基本可以控制苗期病害，大田是病害防治的主要場所[2-3]。土壤中煙草疫霉是否存在及其存在的數量是種植煙草后黑脛病發生、流行的關鍵因素[4]。因此，了解土壤帶菌量、預測土壤黑脛病發病潛力，對病害的精準防控、田間病圃的高效選擇、不同抗性品種的科學布局具有重要的意義。【前人研究進展】目前，從土壤中分離鑒定以及計數煙草疫霉菌的方法已有較多報道。如葉片誘餌法可以檢測以游動孢子形式存在的疫霉菌，進行相對定量[5]；土壤稀釋平板法可以獲得活菌株，定量土壤中的疫霉菌，加上PCR驗證可更有效[6]，但不能區別疫霉菌存在的形式；熒光定量PCR方法可以快捷地對疫霉菌進行鑒定及計數[7-8]，但無法區分死細胞和活細胞，而且技術難度大、成本高，不能在生產上推廣。生產上使用的是以中國煙草行業標準YC/T 341[9]為主的方法，但該方法時間跨度大，涉及整個生產季節，而且主要通過歷年的發病情況結合氣象條件進行預測，不涉及煙草疫霉菌的數量。【本研究切入點】土壤帶菌量與黑脛病的發生關系密切，土壤帶菌檢測的研究較多[5-8]，黑脛病的系統監測與預測也有些研究結果[9,19]，但土壤帶菌預警、預測土壤發病潛力未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究采用選擇性培養基土壤稀釋平板分離、結合PCR驗證量化植煙土壤中的煙草疫霉，假植指示植物室內模擬測定黑脛病發生情況，再經過典型土壤黑脛病的系統調查，嘗試建立一種預測土壤中煙草黑脛病發病潛力的方法，為病害的精準防控、田間病圃的高效選擇、不同抗性品種的科學布局奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植煙土壤的采集

預備種植煙草的土壤樣品取自云南省抗煙草黑脛病改良株系待選試驗點，分別是紅塔區(簡稱H)研和基地、峨山縣(簡稱E)小街由義、石林縣(簡稱S)鹿阜路美邑和上趙、彌渡(簡稱M)新街西莊等5個點10塊試驗田塊，共10個樣品，按采樣地點編號。五點取樣，取樣深度15～20 cm，每點取樣1.0～1.5 kg，將大土塊捏碎，合并、混勻，倒在干凈的牛皮紙上攤成薄層，剔除石塊、植物根莖、昆蟲等雜物，陰干。

1.2 土壤稀釋平板法分離與量化煙草疫霉

1.2.1 土壤前處理 將采集晾干的土壤研碎，過2 mm的土壤篩，收集備用。

1.2.2 選擇性培養基 選擇性培養基由20 %的V8瓊脂培養基[10]添加多菌靈(10 μg/mL)、惡霉靈(50 μg/mL)、五氯硝基苯(25 μg/mL)、利福平(10 μg/mL)、氨芐青霉素(500 μg/mL)以及制霉菌素(25 μg/mL)等抗生素制成[11]。

1.2.3 土壤稀釋平板法分離與量化 稱取過篩后的土壤樣品10 g，放入已滅菌的40 mL水瓊脂(0.25 %)的三角瓶(250 mL)中，上下倒置幾次后，置于漩渦振蕩器上充分混勻，即成5-1土壤稀釋液；吸取5-1土壤稀釋液l mL，移入裝有4 mL無菌水瓊脂的試管中，充分混勻后，即成5-2土壤稀釋液；同樣再稀釋1次，即成5-3土壤稀釋液。所取樣品，均按照上述方法5倍稀釋，每個土樣3 次重復。吸取5-2、5-3土壤稀釋液各200 μl，涂布于選擇性培養基平板上；每個樣品每個稀釋度涂5個平板，置于28 ℃恒溫培養箱中培養48～72 h后，挑選菌落較易區分、菌落數在5～20個的平板，標記疑似菌落，記數[12]，統計每克土樣形成的疑似菌落數[6]。

1.2.4 疑似菌落的PCR驗證及校正量化 挑取少量疑似煙草疫霉菌菌苔(10 mm×10 mm)，按文獻[11]的方法提取微量菌體DNA，采用特異性引物ITS8-1/ ITS8-2擴增[14]驗證，每土樣選取疑似菌落5～50個進行PCR驗證，統計陽性結果的比例，校正定量各土樣中的煙草疫霉。

1.3 土壤假植指示煙草后黑脛病發病測定

1.3.1 土壤前處理 每個土樣取3.0～5.0 kg，輾碎成粒徑為0.5～1.0 cm的土壤顆粒，剔除雜物，裝入32 cm×45 cm×15 cm的篩筐內，將篩筐置于托盤中，在托盤中注入土壤厚度1/3～1/2的潔凈水，濕潤土壤2～3 d，以土壤潮濕、不粘連為宜。

1.3.2 指示煙草的假植培養 指示煙草采用易感病的煙草品種紅花大金元，按常規漂浮育苗方式培育至5～6片真葉苗，挑選長勢整齊的煙苗，拔出、剪除1/4～1/3的末端根際土，形成根創傷后，移栽至裝有土壤樣品的篩筐中，每筐煙苗數至少12株，重復3次。假植煙苗的篩筐置于盛水托盤中，托盤中水的深度為土壤厚度的1/3～1/2，干濕交替，維持土壤濕潤，在25～28 ℃、相對濕度75 %以上、12 h光照12 h黑暗交替的人工氣候室中培養。

1.3.3 病害調查 假植后第2～3 d觀察發病情況，每7 d調查1次病情，共調查5次，煙草黑脛病以株為單位調查，以產生明顯病斑至煙苗凋萎記作發病，以無病斑、煙苗直立、生長正常記作不發病，調查所有煙株，以發病率記錄病情[15]。

1.4 代表土壤黑脛病的系統調查驗證

從假植病害調查中的土樣選取4個不同發病程度的作為代表土樣，溯源田塊，按煙草黑脛病預測預報調查規程要求種植感病煙草品種紅花大金元進行系統觀察[9]，每7 d調查1次，以發病率統計病情[15]。至采收完畢，共調查17次，作調查時間-發病率曲線圖，并采用EXCEL進行回歸分析。

2 結果與分析

2.1 土壤稀釋平板法分離與量化煙草疫霉

培養48～72 h后，不同來源的土樣形成的菌落數明顯不同。根據菌落形態、顏色以及菌絲形態，參照Stamps[16]、Hawksworth[17]等的疫霉分類資料，選取乳白色且呈絨狀的菌落作為疑似菌落，PCR驗證，統計陽性結果的比例，校正定量各土樣中的煙草疫霉(表1)。不同來源土樣PCR驗證陽性結果的比例存在明顯的差異，與文獻[6,11]的結果一致，與土壤微生物類群，特別是與煙草疫霉同屬不同種、腐霉等菌落形態相似的微生物種類干擾有關，但陽性比例仍然在80 %以上，這說明所用的培養基具有良好的選擇性，考慮到土壤記數本身的差異，可以采用陽性比例平均值進行校正，也就是隨機選取50～100個的疑似菌落進行PCR驗證，以此陽性比例校正記數。從校正后土樣煙草疫霉數量統計看，所有測定的土樣均潛伏著煙草疫霉，但不同土樣煙草疫霉的數量存在差異，cfu/g即每克土壤菌落形成單位數反映了土壤中煙草疫霉菌的種群密度，cfu/g 值越大，表明土壤中煙草疫霉菌的密度越大，一旦條件合適，密度越大，煙草黑脛病發生的風險就越高。

表1 疑似菌落PCR驗證結果

2.2 土壤假植指示煙草黑脛病發生情況

土壤假植指示煙草黑脛病發生測定結果表明，10個土壤樣品發病潛力差異明顯，隨時間推延，發病率有所上升，一直不發病的樣品有2個，最后1次調查的發病率<10 %的樣品有1個，發病率介于10 %～20 %(含10 %)的樣品有4個，發病率≥20 %的樣品有3個(表2)。對照土樣煙草疫霉量化結果(表1)可以看出，土壤煙草疫霉含量與發病率顯著相關，疫霉含量越高，發病越嚴重，發病潛力越大；不發病的2個土樣，土壤煙草疫霉含量相對較低；最后1次調查的發病率>10 %的，土壤煙草疫霉含量均在1000 cfu/g以上。說明土壤煙草疫霉含量在1000 cfu/g以上存在較大的發病風險，發病潛力大。

對不同土樣初始煙草疫霉數量(即表1中所示土樣疫霉含量)與煙草發病初期(7 d時的調查結果)和后期(7 d后的調查結果)的發病程度之間進行相關性分析，7、14、21、28、35 d的相關系數r值分別為0.69、0.81、0.93、0.95、0.96，隨著調查時間的推延，從中度相關漸漸上升為高度相關，表明黑脛病發生的時間早晚和發生程度由土壤中初侵染菌源數量決定，當菌量≥1000 cfu/g時發病較快較早，第5次調查的發病率在10 %以上。綜合考慮文獻[6,23]的研究結果和煙草黑脛病預測預報模型[18]，可推出土壤煙草疫霉含量1000 cfu/g是病害經濟閾值。

表2 土壤樣品煙草黑脛病發病情況統計

圖1 代表土壤煙草黑脛病系統監測結果Fig.1 System monitoring incidence of the disease tobacco black shank in representative soil

2.3 代表土壤黑脛病的系統調查驗證

代表土壤煙草黑脛病系統監測結果顯示(圖1)，在不進行防治、溫濕度適宜、不清除病株時，病害呈緩慢發展趨勢，最終發病率可達初始發病率的10～20倍，初始發病率超過5 %，最終發病率可達90 %以上，與土壤假植病害調查結果趨勢基本吻合。從土壤菌量來看，土壤菌量有一個累積過程，隨著菌量的提升，發病率也逐步上升，即使初始菌量不足以發病，但當菌量累積到一定數量時仍會發病，如土樣E1，這也再次證明土壤帶菌是發病的重要前提條件，也證實假植指示煙草是一種較好預測土壤發病潛力的方法。

3 討 論

在煙草黑脛病流行規律研究中發現，煙草黑脛病的發生與溫度、濕度(或降雨)密切相關[19-20]。因此，在煙草黑脛病的預測預報中要將歷年病害系統調查的數據與溫度、濕度(或降雨)數據之間建立模型，通過溫度、濕度(或降雨量)來預測預報病害的發生、發展[21]。這種預測預報注重病害三角關系[22]中環境與寄主的關系，而忽視了病菌與寄主的關系。隨著土壤中煙草疫霉分離、定量技術[3]及熒光定量PCR技術[7-8,23]的發展，使得監測土壤中的煙草疫霉成為可能，相關疫霉的研究表明，土壤中的疫霉菌數量消長規律與田間疫病的流行規律一致[24-25]。研究發現土壤中病菌的數量決定病害發生的嚴重度，病菌含量越大，病害越重[5-6]，本研究也證實了這一點。雖然本研究通過假植預測了病害的發生潛力，但土壤帶菌量僅可作為病害的一種預警方法，而不能直接作為病害預測方法，實際應用要考慮溫度、濕度(或降雨)等環境條件，才能對病害發生做出更準確地預測預報。

4 結 論

1000個/g土壤帶菌量為煙草黑脛病的經濟閾值，據此可以對土壤的病菌進行預警；假植病害調查可以準確地預測土壤煙草黑脛病的發病潛力，表明建立在環境—寄主—病原三角關系的假植預測病害方法是一種相對準確、低成本、簡便易推廣的病害預測方法。

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MethodofForecastingTobaccoBlackShankDiseaseinSoil

FANG Dun-huang, XIAO Bing-guang, TONG Zhi-jun, ZENG Jian-min

(Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650031, China)

【Objective】 Forecast of tobacco black shank was studied in order to prevent and control of diseases accurately, select field disease nursery efficiently, and lay out different resistant varieties scientifically. 【Method】Disease potentiality ofPhytophthoranicotianain the soil was calculated by soil dilution plate counting method and soil planting disease investigation method, and field disease system was used to inverstigate and validate the disease of tobacco black shank used temporary planting indicator tobacco in the representative soil of the field. 【Result】 Quantification ofPhytophthoranicotianain the soil and the incidence of the disease were closely related, and the higher the density of the pathogen was, the more seriously the disease occurred and expanded. As the time went on, the higher initial incidence disease was, the more seriously the successor disease occurred. And the final disease incidence was 10-20 times as many as the initial incidence.Phytophthoranicotianawidely existed in the soil, and it was isolated from all collected soil. When the accumulative density of the fungus was 1000 cfu/g soils, the disease occurred. Disease potentiality ofPhytophthoranicotianacould be accurately forecast incidence of the disease of tobacco black shank in soil by 3-5 times.【Conclusion】According to the disease threshold 1000 cfu/g soil, we could early warn the pathogenic bacterium in the soil. So in view of relationship between environment, host and pathogen, the method of disease prediction was a relatively accurate, low cost, simple and easy to promote by tobacco seedling transplanting soil.

Phytophthoranicotiana；Soil dilution planting；Soil temporary planting；Disease investigation；Disease forecasting

1001-4829(2017)10-2246-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.015

2016-03-17

中國煙草總公司科技計劃項目(110201301006、2014TBB01、110201601027)；中國煙草總公司云南省公司科技計劃項目(2012YN05、2013YN01、2016YN23)

方敦煌(1967-)，男，副研究員，博士，主要從事煙草病害及其防治研究，E-mail：fdhkm@sina.com。

S435.72

A

(責任編輯 王家銀)