藍莓帚梗柱孢枝枯病病原菌鑒定及生物學特性

費諾亞，李 媛，石凌波，孟婷婷，傅俊范，嚴雪瑞

(沈陽農業大學植物保護學院，遼寧 沈陽 110866)

藍莓帚梗柱孢枝枯病病原菌鑒定及生物學特性

費諾亞，李 媛，石凌波，孟婷婷，傅俊范，嚴雪瑞*

(沈陽農業大學植物保護學院，遼寧 沈陽 110866)

【目的】2015年6月在來自湖北隨州的藍莓苗木中，發現一種由帚梗柱孢霉引起的枝枯病。本研究開展了致病菌的鑒定工作，為病害的防治提供指導。【方法】病樣分離物通過組織分離、單孢分離及純化后，用柯赫氏法則進行了致病性測定。致病菌的鑒定采用形態學、ITS序列比對及基于EF-1α，β-tubulin和Histone 3三段基因的系統發育樹的聯合確定，同時本研究對病原菌的生物學特性進行了測定。【結果】通過分離及致病菌測定后，選取代表菌株HBSZ05Ba進一步研究。形態學特征及ITS比對結果均將代表菌株劃分入帚梗柱孢霉屬球狀囊泡組，三段基因聯合系統發育樹結果表明，該病害的病原菌為Cylindrocladiumcanadense(有性態為Calonectriacanadensis)。生物學特性試驗結果表明：菌絲生長最適溫度為25 ℃，最適培養基為PDA，光照對菌落生長無明顯影響，最適氮源為NaNO3，最適碳源為可溶性淀粉。【結論】湖北隨州藍莓枝枯病病原菌經鑒定為C．canadense，該種真菌在藍莓上的為害屬首次報道。

藍莓；枝枯病；鑒定；生物學特性

【研究意義】藍莓 (英文Blueberry)，世界范圍的一種新興小漿果樹種，指原產北美地區的杜鵑花科 (Ericaceae) 越橘屬 (Vaccinium) 中藍果類型植物。根據吳林研究顯示[1]，至2015年在全國超過20個省市區開展了藍莓種植，總面積約3×108m2，產量達2.5×107kg。隨著種植面積與產量的逐年上升，病害的種類也逐年增大，尤其是枝枯類病害對藍莓品質造成的影響不容忽視。【前人研究進展】麗赤殼屬真菌(Calonectria) 和其無性態帚梗柱孢霉屬 (Cylindrocladium) 是在全世界范圍廣泛分布的重要植物病原真菌，尤其是在亞熱帶和熱帶地區，寄主范圍廣，存在于土壤或植物病殘體中，引起多種植物病害，如根腐病、猝倒病等[2]。【本研究切入點】2015年在一批來自湖北隨州的藍莓苗木中，在品種‘埃利奧特’的植株上，發現一種帚梗柱孢霉引起的枝枯病，其癥狀是莖部出現表皮干枯，并伴有開裂，干枯部可環繞枝條。【擬解決的關鍵問題】為鑒定該病害的病原，本文對病原菌進行了分離純化與鑒定，并對該病原菌生物學進行了研究。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離純化

分離：采用常規的組織分離法[3]，取具有典型癥狀病害樣品的病健交界處切塊并進行表面消毒后置于PDA平板 (d=90 mm) ，25 ℃條件下培養，觀察菌落形態，統計分離頻率。

純化：將分離得到的菌株轉至SNA培養基25 ℃培養[4]，產孢后進行單孢分離純化，以無菌水洗脫分生孢子制成懸浮液。吸取孢懸液0.1 mL至4 % WA平板上，使用滅菌的L型涂布器將孢懸液均勻涂布于平板表面，靜置10 min。將WA平板切成0.4 cm×0.4 cm的小塊，逐個鏡檢，選擇載有單個孢子的瓊脂塊移至PDA上培養。

保存：將純化后的菌株轉至PDA斜面上，4 ℃保存。

1.2 病原菌致病性測定

采用活體傷口接種法，挑選健康的兩年生‘埃利奧特’品種藍莓植株，無菌水洗凈并用酒精棉消毒后，用滅菌刀片在植株枝條上造成輕微傷口，將供試菌株HBSZ05Ba在PDA上活化3 d后，使用滅菌打孔器于菌落邊緣處打取菌餅 (d=5 mm) 貼在滅菌脫脂棉上，將脫脂棉分別貼靠在枝條的傷口上，使菌絲與傷口充分接觸，纏繞保鮮膜固定保濕，3次重復，對照試驗中將菌餅替換為無菌PDA塊。25 ℃條件下48 h后摘掉脫脂棉并觀察發病情況，持續噴水保濕，5 d后再次觀察結果并記錄。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態學鑒定 參照Crous[5]的研究，對病原菌的形態學進行鑒定，觀察在25 ℃、SNA培養基上培養10 d時的分生孢子形態與囊泡形狀等。

1.3.2 分子生物學鑒定 病原菌DNA提取：供試菌株活化培養3 d后，打菌餅 (d=5 mm) 接種到PD液體培養基中，室溫條件下使用回旋振蕩器 (130 r/min) 培養5 d后收集菌絲，菌絲體冷凍干燥備用。基因組DNA提取采用CTAB法，并置于-20 ℃冰箱中保存待用。

ITS序列擴增及比對：使用引物序列見表1。PCR擴增產物經凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程有限公司進行測序，結果在Genbank數據庫進行BLAST比對分析。

EF-1α，β-tubulin及Histone 3擴增與系統發育分析：引物序列見表1。挑選出與目標菌株序列相近的已知種及帚梗柱孢霉屬球形囊泡組的模式菌株序列進行系統發育分析，參考菌株相關信息見表2。用軟件ClustalX2.1對所有序列進行對位排列 (alignment)；使用軟件MEGA7對EF1-α，β-tubulin及Histone 3[6]聯合基因采用最大似然法 (ML) 構建系統發育樹，以C．colhounii作為外群。

1.4 病原菌生物學特性

對病原菌在不同條件下的菌絲生長情況進行測定，以全光照、全黑暗、12 h光暗交替作為不同光照條件；不同溫度條件選擇5、10、15、20、25、30、35 ℃。將病原菌接種在PDA上，并于不同光照、溫度條件下培養。以查氏培養基作為不同碳源與氮源的基礎培養基，不同碳源選擇與查氏中蔗糖等量的葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖；不同氮源選擇與查氏中NaNO3等量的半胱氨酸、甘氨酸、NH4H2PO4、(NH4)2SO4。將活化3 d的病原菌接種至上述不同氮源、碳源培養基，25 ℃恒溫培養條件。上述每個處理重復3次，分別在3，5，7 d測量平板上菌落直徑。數據通過Excel求取平均值等。

表1 使用引物及序列

表2 構建系統發育樹的參考菌株相關信息

2 結果與分析

2.1 病樣采集與病原菌分離純化

帚梗柱孢霉枝枯病的癥狀是莖部出現表皮干枯，并伴有開裂，干枯部可環繞枝條，后期致整枝枯死，剖開發病莖部可見維管束未受害 (圖1，A)。

經組織分離與單孢分離，得到了一株真菌編號為HBSZ05Ba，25 ℃條件下其菌落在PDA培養基上初期菌落白色圓形，邊緣整齊，氣生菌絲生長旺盛，絨毛狀，7 d左右可生長至90 mm (圖1，H)，分離頻率為75 %。

2.2 病原菌致病性測定

健康的藍莓植株活體枝條在接種HBSZ05Ba后48 h揭去菌絲塊時，即可觀察到明顯的發病情況，病斑平均長度達1 cm，接種5 d時觀察病斑擴展至5 cm，而空白對照組枝條未發病 (圖1，B，C，D)。從接種發病的部位可重新分離到與接種菌相同的菌株，而對照組植株不發病，證明所分離接種的菌株為造成藍莓枝枯病的病原菌。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態學鑒定 分離得到的菌株HBSZ05Ba，分生孢子無色，直圓柱型，兩端鈍圓，無隔膜或具1個隔膜，分隔處不具明顯可見的縊痕 (圖1，G)，大小為 (45.0～68.1) × (3.2～5.4) μm，平均62.9 × 4.5 μm。分生孢子梗末端囊泡梨形至球狀，直徑5～11 μm (圖1，E)。在SNA培養基上無超大孢子、小孢子或小型子囊殼形成。PDA培養7 d時菌落開始產生厚垣孢子，呈紅褐色 (圖1，F)。

2.3.2 分子生物學鑒定 經檢測，所提取的DNA濃度為51 ng/μl。將測序得到的菌株ITS，EF1-α，β-tubulin及Histone 3序列提交到NCBI/GenBank獲得的基因登錄號(ITS-KY984067，EF1-α-KY978481，β-tubulin-KY978482，Histone 3-KY978483)，ITS序列在NCBI中的BLAST結果表明，供試菌株的ITS序列與C.canadensis的同源性達100 %。將供試菌株的EF1-α，β-tubulin及Histone 3基因序列與文獻中的模式菌株在NCBI上下載的模式菌株的序列進行聯合的系統發育分析，結果與UFV 76以及CBS 110817 (C.canadensis) 聚在同一分支 (圖2)。

A．原始發病癥狀；B．致病性測定5 d時；C．5 d時的對照組；D.接種5 d時的處理組；E．分生孢子梗末端囊泡 (SNA培養基)，標尺=2 μm；F．厚垣孢子 (PDA培養基)，標尺= 20 μm；G．分生孢子形態 (SNA培養基)，標尺=50 μmA．Natural symptoms of stem blight on blueberry；B．Pathogenicity tests after 5 d；C．CK in pathogenicity tests after 5 d；D.Symptoms of inoculated blueberry after 5 d；E．Sphaeropedunculate vesicle，bar=2 μm；F．Chlamydospores on PDA，bar=20 μm；G．Macroconidium on SNA，bar=50 μm圖1 HBSZ05Ba所致癥狀及菌株形態Fig.1 Symptoms on blueberry caused by Cylindrocladium canadense and morphology of the fungal isolate HBSZ05Ba

采取最大似然法 (ML) 基于Kimura 2-parameter模型進行分析，使用軟件MEGA7 建立EF-1α，β-tubulin及Histone 3三段基因聯合基因系統發育樹。以Calonectria colhounii為外群，HBSZ05Ba與 Calonectria canadensis(anamorph Cylindrocladium canadense)聚為一支，Bootstrap值=100%Maximum likelihood method tree based on the Kimura 2-parameter model generated from the combined EF-1α，β-tubulin and Histone 3 genes by MEGA 7．The tree is rooted with Calonectria colhounii，the isolate HBSZ05Ba belongs to Calonectria canadensis(anamorph Cylindrocladium canadense)．Bootstrap values=100%圖2 基于EF1-α，β-tubulin及Histone 3三段基因聯合系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on combined EF1-α，β-tubulin and Histone 3 gene

2.4 病原菌生物學特性

主要的生物學特性試驗結果表明：菌絲生長最適溫度為25 ℃不同溫度對菌絲生長速率影響明顯，5與35 ℃條件下菌絲不能生長 (圖1，H)；選取的幾種培養基中，在PDA培養基上菌絲生長最快；不同光照條件對菌落生長無明顯影響；最適氮源為NaNO3，最適碳源為可溶性淀粉。

3 討 論

目前國內已報道的藍莓枝枯病原主要有葡萄座腔菌 (Botryosphaeriadothidea)[9]、小新殼梭孢 (Neofusicoccumparvum)[9]、棒狀擬盤多毛孢 (Pestalotiopsisclavispora)[10]、新擬盤多毛孢 (Neopestalotiopsischrysea)[11]、烏飯樹擬莖點霉 (Phomopsisvaccinii)[12]、間座殼潰瘍病菌 (Diaporthephaseolorum)[13]、尖孢炭疽菌 (Colletotrichumacutatum)[14]、膠孢炭疽菌 (C．Gloeosporioides)[14]，可可毛色二孢 (Lasiodiplodiatheobromae)[9]以及假可可毛色二孢 (L．pseudotheobromae)[15]，且不斷有新的藍莓枝枯病病原被鑒定出來。不同的病原菌在生物學特性方面可能存在差異，因此研究病原的生物學特性十分必要。

根據Crous的研究[5]，帚梗柱孢霉屬分類的重要特征是囊泡的形狀，然而球形囊泡與梨形或卵圓形易混淆[16]，因此還需進一步的分子生物學鑒定。Lombard等[7]對Calonectria屬的多個種進行了ACT，BT，CAL，HIS3，ITS，LSU以及EF-1α共7段基因的多基因聯合系統發育分析，將該屬分為13個系統發育組 (group)，并根據系統發育結果得出，未知的Calonectria屬菌株可通過EF-1α，β-tubulin及Histone 3 3段基因進行鑒定。本次分離到的菌株HBSZ05Ba與曾經在藍莓上報道的引起葉斑病的柯氏帚梗柱孢[8]在形態學、ITS序列上以及系統發育樹中均可以區分。

4 結 論

經形態學與系統發育研究確定引起湖北隨州藍莓枝枯病的病原菌為C．canadense，這是該種真菌為害藍莓的首次報道，此為區別于的C．colhounii[8]又一帚梗柱孢霉屬新種群為害藍莓的報道。生物學特性試驗結果表明，溫度與碳源氮源對菌絲生長影響明顯，而光照條件無影響。

[1]吳 林.中國藍莓35年——科學研究與產業發展[J].吉林農業大學學報，2016，38(1)：1-11.

[2]Crous P W，Groenewald J Z，Risède J M，et al.Calonectriaspecies and theirCylindrocladiumanamorphs：species with sphaeropedunculate vesicles[J].Studies in Mycology，2004，18(2004)：415-430.

[3]方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1998.

[4]Lombard L，Crous P W，Wingfield B D，et al.Species concepts inCalonectria(Cylindrocladium)[J].Studies in Mycology，2010，66(66)：1.

[5]Crous P W.Taxonomy and pathology ofCylindrocladium(Calonectria) and allied genera[M].St.Paul，Minnesota，U.S.A.：APS Press，2002.

[6]Chen S F，Lombard L，Roux J，et al.Novel species ofCalonectriaassociated withEucalyptusleaf blight in Southeast China[J].Persoonia Molecular Phylogeny & Evolution of Fungi，2011，26(1):1.

[7]Lombard L，Crous P W，Wingfield B D，et al.Phylogeny and systematics of the genusCalonectria[J].Studies in Mycology，2010，66(1)：31-69.

[8]Luan Y S，Feng L，An L J.First Report of Blueberry Leaf Spot Caused byCylindrocladiumcolhouniiin China[J].Plant Disease，2007，90(12)：1553-1553.

[9]Xu C，Zhang H，Zhou Z，et al.Identification and distribution ofBotryosphaeriaceaespecies associated with blueberry stem blight in China[J].European Journal of Plant Pathology，2015，143(4)：737-752.

[10]Zhao H H，Yue Q H，Liang C.The pathogen causingPestalotiopsistwig dieback of blueberry.[J].Mycosystema，2014，33(3)：577-583.

[11]Shi L，Li Y，Fei N，et al.First Report ofNeopestalotiopsischryseacauing twig dieback of Rabbiteye blueberry (Vacciniumashei) in China[J].Plant Disease,2017，101(3)：506.

[12]岳清華，趙洪海，梁 晨，等.藍莓擬莖點枝枯病的病原[J].菌物學報，2013，32(6)：959-966.

[13]李 媛，石凌波，費諾亞，等.藍莓間座殼莖潰瘍病病原鑒定及生物學特性研究[J].植物保護，2017，43(1)：89-94.

[14]徐成楠，王亞南，胡同樂，等.藍莓炭疽病病原菌鑒定及致病性測定[J].中國農業科學，2014，47(20)：3992-3998.

[15]王佳寧，趙洪海，尉瑩瑩，等.藍莓毛色二胞枝枯病的病原菌[J].菌物學報，2016，35(6)：657-665.

[16]Hirooka Y，Ishikawa S，Takeuchi J，et al.NewCylindrocladiumdiseases of strawberry and coral bells caused byCylindrocladiumcanadense[J].Journal of General Plant Pathology，2009，75(1)：83-86.

IdentificationofCylindrocladiumPathogenofBlueberryStemBlightandBiologicalCharacteristicsTests

FEI Nuo-ya，LI Yuan，SHI Ling-bo，MENG Ting-ting，FU Jun-fan，YAN Xue-rui*

(College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Liaoning Shenyang 110866，China)

【Objective】A new kind of stem blight caused byCylindrocladiumwere found on blueberry from Hubei Suizhou．Several studies were conducted to identify the pathogen and provide theoretical foundation for the disease control．【Method】The pathogen of the disease was isolated and purified and pathogenicity was determined by Kochs postulate．The isolate from blueberry was identified based on morphology, BLAST of ITS and molecular phylogenetic combined TEF-1α，β-tubulin and Histone 3．The biological characteristics were studied．【Result】According to morphology and BLAST of ITS, the represenitive isolate HBSZ05Ba belongs toCylindrocladiumspp．of sphaeropedunculate vesicle. Phylogenetic tree showed that the isolate wasC．canadense(teleomorphCalonectriacanadensis)．The biological tests showed that 25 ℃，PDA was the best colony growth conditions．Different light conditions had no significant effect on the colony growth．The optimum carbon source is soluble starch and the optimum nitrogen source is NaNO3．【Conclusion】The pathogen of stem blight found on blueberry from Hubei Suizhou in June 2015 was identified asC．canadense．It is the first report that this fungus can cause stem blight on blueberry．

Blueberry; Stem blight;Identification; Biological characteristics

1001-4829(2017)10-2251-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.016

2017-04-27

公益性行業(農業)科研專項(201103037)；沈陽市科技計劃資助項目(F15-167-4-00，F15-079-3-00)

費諾亞(1994-)，碩士，主要研究植物病理學，E-mail：13478871952@163.com，*為通訊作者：嚴雪瑞，博士，教授，從事園藝植物病理學研究；E-mail：berrypest@126.com。

S435.661

A

(責任編輯 李 潔)