喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4表達變化及其意義

王亞莉，葛建榮

(1青海省人民醫院，西寧810000；2蘇州大學附屬第一醫院)

·臨床研究·

喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4表達變化及其意義

王亞莉1，葛建榮2

(1青海省人民醫院，西寧810000；2蘇州大學附屬第一醫院)

目的探討染色質區解旋酶DNA結合蛋白5(CHD5)、E- 鈣黏蛋白(E- cadherin)、Smad家族成員4(Smad4)在喉鱗癌組織中的表達變化及其意義。方法選擇喉鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織各35例份，采用免疫組化SP法檢測兩種組織CHD5、E- cadherin、Smad4表達。比較兩種組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達，分析喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達的關系及其與患者臨床病理參數和預后的關系。結果喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達率均低于癌旁正常組織(P均<0.05)。相關分析顯示，喉鱗癌組織CHD5陽性表達與Smad4陽性表達呈正相關關系(r=0.810，P<0.05)，與E- cadherin陽性表達無相關性(r=-0.263，P>0.05)，E- cadherin陽性表達與Smad4陽性表達呈正相關關系(r=0.481，P<0.05)。喉鱗癌組織CHD5陽性表達與淋巴結轉移、TNM分期有關，E- cadherin陽性表達與組織分化程度、淋巴結轉移有關，Smad4陽性表達與淋巴結轉移有關(P均<0.05)。CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達者術后生存時間>3年比例明顯高于其陰性表達者(P均<0.05)。結論喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4低表達，其表達變化與喉鱗癌的惡性生物學行為和患者預后有關。

喉鱗狀細胞癌；染色質區解旋酶DNA結合蛋白5；E- 鈣黏蛋白；Smad家族成員4

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤率的3%，其組織學類型以鱗癌最常見[1]。喉鱗癌具有易復發和轉移等惡性生物學行為，是影響患者預后的重要因素[2]。目前認為，腫瘤的復發和轉移是多因素共同作用的結果。有研究證實，染色質區解旋酶DNA結合蛋白5(CHD5)基因缺失與多種腫瘤的復發和轉移密切相關，如乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肺癌等[3～7]。上皮間質轉化(EMT)在胚胎發育、組織發生等生理過程中具有重要作用。E- 鈣黏蛋白(E- cadherin)、Smad家族成員4(Smad4)等是EMT重要的分子生物學標記物。近年研究發現，在多種腫瘤組織中可見E- cadherin、Smad4表達改變，表明EMT可參與多種腫瘤的發生、發展[8]。2012年3月～2015年9月，本研究觀察了喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4表達變化，并分析其與患者臨床病理參數和預后的關系。

1 臨床資料

1.1 基本資料 選擇同期青海省人民醫院和蘇州大學附屬第一醫院收治的喉鱗癌患者35例。所有患者術前未行任何抗腫瘤治療，術后經組織病理檢查明確診斷。排除合并心、肝、腎等重要臟器疾病，免疫系統疾病，感染性疾病以及嚴重的心腦血管疾病。其中，男18例、女17例，年齡(58.21±12.37)歲；組織分化程度：高分化21例，中低分化14例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期23例，Ⅲ、Ⅳ期12例；有淋巴結轉移24例，無淋巴結轉移11例。本研究經青海省人民醫院和蘇州大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意。結果分析采用SPSS20.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

1.2 喉鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織CHD5、E- cadherin、Smad4表達 取手術切除的喉鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣≥1 cm)，4%中性甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。切片常規脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育，微波抗原修復；加入正常山羊血清室溫封閉20 min，棄去血清，分別滴加CHD5、E- cadherin和Smad4一抗工作液(稀釋倍數1∶150)，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌5 min×3次，加入生物素標記的二抗(稀釋倍數1∶200)，室溫孵育30 min；PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。以PBS替代一抗作陰性對照。判定標準：CHD5陽性表達主要定位于細胞核，E- cadherin陽性表達主要定位于細胞膜，Smad4陽性表達主要定位于細胞質。隨機選取10個含有陽性細胞的400倍視野進行觀察。陽性細胞所占比例：無陽性細胞為0分，陽性細胞所占比例≤25%為1分，陽性細胞所占比例>25%～50%為2分，陽性細胞所占比例>50%為3分；染色程度：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分。按陽性細胞所占比例和染色程度綜合判定[9]，二者之和>3分為陽性表達、≤3分為陰性表達。結果顯示，喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達率分別為42.86%(15/35)、45.71%(16/35)、40.00%(14/35)，癌旁正常組織分別為97.14%(34/35)、91.42%(32/35)、94.29%(33/35)。喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達率均低于癌旁正常組織(P均<0.05)。

1.3 喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達的關系 15例CHD5陽性表達者中E- cadherin均為陰性表達，Smad4陽性表達1例、陰性表達14例；Spearman等級相關分析顯示，喉鱗癌組織CHD5陽性表達與Smad4陽性表達呈正相關關系(r=0.810，P<0.05)，與E- cadherin陽性表達無相關性(r=-0.263，P>0.05)。16例E- cadherin陽性表達者中，Smad4陽性表達3例、陰性表達13例；Spearman等級相關分析顯示，喉鱗癌組織E- cadherin陽性表達與Smad4陽性表達呈正相關關系(r=0.481，P<0.05)。

1.4 喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達與患者臨床病理參數的關系 見表1。

表1 喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達與患者臨床病理參數的關系

1.5 喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達與患者預后的關系 所有患者術后隨訪1～36個月，記錄術后生存時間。其中，術后生存時間>3年19例、≤3年16例。15例CHD5陽性表達者中，術后生存時間>3年11例(73.33%)；20例CHD5陰性表達者中，術后生存時間>3年5例(25.00%)。16例E- cadherin陽性表達者中，術后生存時間>3年12例(75.00%)；19例E- cadherin陰性表達者中，術后生存時間>3年4例(21.05%)。14例Smad4陽性表達者中，術后生存時間>3年11例(78.57%)；21例Smad4陰性表達者中，術后生存時間>3年5例(23.81%)。CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達者術后生存時間>3年比例均明顯高于其陰性表達者(P均<0.05)。

2 討論

目前認為，侵襲和轉移是導致喉鱗癌患者預后不良的主要原因，故早期發現其侵襲和轉移的證據具有重要意義。但臨床上缺少判定喉鱗癌早期發生侵襲和轉移的分子生物學標記物[10]。

CHD5屬于ATP依賴染色質重塑酶，能夠通過水解ATP提供能量，改變染色質中核小體的位置，從而改變組蛋白與DNA鏈之間的空間構象，調控目的基因的轉錄活性[11]。研究發現，CHD5在霍奇金淋巴瘤、皮肌炎等多種疾病以及超過50%的腫瘤中異常表達[12]。本研究結果顯示，喉鱗癌組織CHD5陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，其陽性表達與淋巴結轉移、TNM分期有關，且其陽性表達者術后生存時間>3年比例明顯高于陰性表達者，與Wang等[13]研究結果一致。說明CHD5在喉鱗癌的發生過程中可能具有抑癌基因作用。

EMT是腫瘤侵襲和轉移的關鍵步驟，涉及到多種蛋白分子，如鈣連接素。E- cadherin是鈣連接素中影響腫瘤侵襲和轉移的一種重要蛋白，在多種腫瘤組織中異常表達，并與腫瘤的去分化、淋巴結轉移以及患者預后不良有關[14]。研究證實，E- cadherin在喉鱗癌細胞黏附紊亂中發揮重要作用，但其與喉鱗癌患者臨床病理參數的關系仍存在爭議。本研究結果發現，喉鱗癌組織E- cadherin陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，其陽性表達與腫瘤組織分化程度、淋巴結轉移有關，且其陽性表達者術后生存時間>3年比例明顯高于陰性表達者。提示E- cadherin參與了喉鱗癌細胞的EMT過程，其陽性表達升高可促進腫瘤的侵襲和轉移。

轉化生長因子β(TGF- β)是已知誘導腫瘤細胞發生EMT的重要因子，而Smad4是TGF- β信號轉導通路中的一個關鍵性因子[15]。已有研究證實，Smad4缺失可促進原癌基因活化，使腫瘤發生侵襲和轉移[16～18]。Papageorgis等[19]研究認為，Smad4具有抑癌基因功能，其表達缺失是多種腫瘤患者預后不良的獨立影響因素。本研究結果顯示，喉鱗癌組織Smad4陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，其陽性表達與淋巴轉移有關，且其陽性表達者術后生存時間>3年比例明顯高于陰性表達者。表明Smad4表達變化有助于判斷喉鱗癌的疾病進程及評估患者預后。

CHD5參與組成CHD5/MTA3/NuRD復合物，該復合物能夠與Snail(E- cadherin的上游負性調控基因)競爭性結合至E- cadherin啟動子區，從而促進E- cadherin基因的轉錄[20]。本研究發現，CHD5與Smad4、E- cadherin與Smad4均呈正相關關系，三者均與淋巴結轉移有關；在喉鱗癌淋巴結轉移過程中CHD5與Smad4、E- cadherin與Smad4可能發揮協同作用。本研究并未發現CHD5與E- cadherin存在相關性，可能與研究病例數較少有關。

綜上所述，喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4低表達，其表達變化與喉鱗癌的惡性生物學行為和患者預后有關。CHD5、E- cadherin、Smad4有可能作為評價喉鱗癌惡性生物學行為的潛在指標，并可為其治療提供有價值的靶標。

[1] Marur S, Forastiere AA. Head and neck squamous cell carcinoma: update on epidemiology, diagnosis, and treatment[J]. Mayo Clin Proc, 2016,91(3):386- 396.

[2] Taguchi T, Nishimura G, Takahashi M, et al. Treatment results and prognostic factors for advanced squamous cell carcinoma of the head and neck treated with salvage surgery after concurrent chemoradiotherapy[J]. Int J Clin Oncol, 2016,21(5):869- 874.

[3] Xie CR, Li Z, Sun HG, et al. Mutual regulation between CHD5 and EZH2 in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2015,6(38):40940- 40952.

[4] Wu X, Zhu Z, Li W, et al. Chromodomain helicase DNA binding protein 5 plays a tumor suppressor role in human breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2012,14(3):R73.

[5] Lang J, Tobias ES, Mackie R. Preliminary evidence for involvement of the tumour suppressor gene CHD5 in a family with cutaneous melanoma[J]. Br J Dermatol, 2011,164(5):1010- 1016.

[6] Wong RR, Chan LK, Tsang TP, et al. CHD5 downregulation associated with poor prognosis in epithelial ovarian cancer[J]. Gynecol Obstet Invest, 2011,72(3):203- 207.

[7] Zhao R, Yan Q, Lv J, et al. CHD5, a tumor suppressor that is epigenetically silenced in lung cancer[J]. Lung Cancer, 2012,76(3):324- 331.

[8] Park JW, Park DM, Choi BK, et al. Establishment and characterization of metastatic gastric cancer cell lines from murine gastric adenocarcinoma lacking Smad4, p53, and E- cadherin[J]. Mol Carcinog, 2015,54(11):1521- 1527.

[9] Mathew J, Pathrose S, Kottoor J, et al. Evaluation of an indigenously prepared Herbal extract (EndoPam) as an antimicrobial endodontic irrigant: an ex vivo study[J]. J Int Oral Health, 2015,7(6):88- 91.

[10] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2017[J]. CA Cancer J Clin, 2017,67(1):7- 30.

[11] Zhou CY, Narlikar GJ. Analysis of nucleosome sliding by ATP- dependent chromatin remodeling enzymes[J]. Methods Enzymol, 2016(573):119- 135.

[12] Kolla V, Zhuang T, Higashi M, et al. Role of CHD5 in human cancers: 10 years later[J]. Cancer Res, 2014,74(3):652- 658.

[13] Wang J, Chen H, Fu S, et al. The involvement of CHD5 hypermethylation in laryngeal squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncol, 2011,47(7):601- 608.

[14] 魯海珍，劉尚梅.E- cadherin和COX- 2蛋白在胃癌組織中的表達及臨床意義[J].中國腫瘤臨床，2013，40(8)：458- 461.

[15] Massagué J. TGFβ signalling in context[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012,13(10):616- 630.

[16] Bornstein S, White R, Malkoski S, et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation[J]. J Clin Invest, 2009,119(11):3408- 3419.

[17] Xia X, Wu W, Huang C, et al. SMAD4 and its role in pancreatic cancer[J]. Tumour Biol, 2015,36(1):111- 119.

[18] Yang J, Wang Y, Zeng Z, et al. Smad4 deletion in blood vessel endothelial cells promotes ovarian cancer metastasis[J]. Int J Oncol, 2017,50(5):1693- 1700.

[19] Papageorgis P, Cheng K, Ozturk S, et al. Smad4 inactivation promotes malignancy and drug resistance of colon cancer[J]. Cancer Res, 2011,71(3):998- 1008.

[20] Kolla V, Naraparaju K, Zhuang T, et al. The tumour suppressor CHD5 forms a NuRD- type chromatin remodelling complex[J]. Biochem J, 2015,468(2):345- 352.

青海省自然科學基金資助項目(2016- K- 9P4)。

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.015

R739.65

B

1002- 266X(2017)36- 0049- 03

2017- 05- 03)