轉(zhuǎn)色期間釀酒葡萄中花色苷的監(jiān)測(cè)及變化研究

閆衡++高娟

葡萄酒的色度是評(píng)價(jià)葡萄酒外觀質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，其色度的高低與葡萄酒中花色苷的種類(lèi)與含量有著密切聯(lián)系。葡萄酒中花色苷來(lái)源于釀酒葡萄，因而葡萄酒的色度很大程度上取決于釀酒葡萄中花色苷的積累。

花色苷是葡萄與葡萄酒中重要的多酚類(lèi)物質(zhì)，屬于水溶性植物色素，在葡萄轉(zhuǎn)色期期間于葡萄漿果的表皮細(xì)胞組織中合成，在液泡中積累，少數(shù)存紅葡萄的果肉細(xì)胞及葡萄籽中。最初合成的是花青素和花翠素的葡萄糖苷，然后轉(zhuǎn)變成其他類(lèi)型的花色苷。不同種或品種葡萄都具有自己獨(dú)特的花色苷類(lèi)型，其總量及組成比例對(duì)葡萄和葡萄酒的顏色至關(guān)重要。對(duì)釀酒葡萄中花色苷合成研究對(duì)夠提高葡萄及葡萄酒的感官品質(zhì)有著重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)花色苷的研究主要集中在對(duì)葡萄及葡萄酒中花色苷種類(lèi)的定性及其穩(wěn)定性方面，部分研究涉及到了花色苷功能活性。但針對(duì)葡萄在轉(zhuǎn)色過(guò)程中花色苷種類(lèi)及含量的變化的監(jiān)測(cè)研究較少出現(xiàn)。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于花色苷的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并未有明確規(guī)定。試驗(yàn)研究中常用方法主要有紙層析與薄層板層析、紫外-可見(jiàn)光譜法、高效液相色譜法、花色苷水解法等。其中，高效液相色譜法（HPLC）最為常見(jiàn)，可用于花色苷的定性和定量測(cè)定，但由于目前商業(yè)上可提供的花色苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有限，所以高效液相色譜多與質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）進(jìn)行花色苷的定性分析。

本試驗(yàn)使用錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)已有花色苷檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，并針對(duì)轉(zhuǎn)色期間的三種釀酒葡萄的果皮中花色苷的變化進(jìn)行研究，討論了花色苷在轉(zhuǎn)色過(guò)程中種類(lèi)及含量的變化趨勢(shì)，為葡萄中花色苷的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

材料與方法

試劑與儀器。Ultimate 3000型雙三元二維液相色譜儀（美國(guó)Dionex 公司）；Agilent 1290-6460超高效液相色譜儀-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；CP224S型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；100?L～1000?L移液器、20?L～200?L移液器（德國(guó)Witeg公司）；0.45?m有機(jī)相濾膜（中國(guó)上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

錦葵色素3-O-葡萄糖苷（98%，美國(guó)Chromadex公司）；蒸餾水（中國(guó)廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜純（德國(guó)Merck公司）。

樣品葡萄來(lái)源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，選取赤霞珠、品麗珠、西拉三個(gè)品種釀酒葡萄作為研究對(duì)象，自轉(zhuǎn)色期前每7天均勻取樣，至葡萄完全成熟。葡萄樣品采摘后低溫保藏。樣品酒來(lái)源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2017年自種赤霞珠葡萄采用傳統(tǒng)釀造工藝釀成，釀成后低溫保藏。

實(shí)驗(yàn)方法。

（1）溶液配制與樣品處理。標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)量5.0mg錦葵色素3-O-葡萄糖苷，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用甲醇：水=1：1（磷酸調(diào)pH=1.5）溶液溶解并定容，充分搖勻，配制成500mg/L錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃冷藏保存。標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：準(zhǔn)確量取500mg/L錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.04mL、0.1mL、0.2mL、1mL、2mL、4mL，用甲醇：水=1：1（磷酸調(diào)pH=1.5）溶液定容至100mL容量瓶中并充分搖勻，配制成0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃冷藏保存。葡萄樣品處理：挑選著色均勻葡萄，剝出果皮均質(zhì)后，準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品5.00g于50 mL聚乙烯管，加入浸提液（甲醇：水=1：1，磷酸調(diào)pH=1.95）10mL，超聲10min，渦旋5 min，重復(fù)2次，14000 r/min冷凍離心5 min，取上層清液過(guò)0.45μm 有機(jī)膜后進(jìn)樣分析。葡萄酒樣品處理：葡萄酒樣品經(jīng) 0.45μm膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析。

（2）色譜條件。對(duì)葡萄浸提液中花色苷的檢測(cè)色譜條件參考已有所檢測(cè)條件并加以驗(yàn)證，具體條件如下：色譜柱：CAPCELL PAK C18 ACR（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A：乙腈：水=60：40；B：乙腈：水=5：95（均使用磷酸調(diào)pH=1.5）；進(jìn)樣體積：10?L；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：520 nm；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

（3）質(zhì)譜條件。正離子掃描（ESI+，m/z 100～600），毛細(xì)管電壓：3.50kV；裂解電壓：125V；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11L/min；脫溶劑氣溫度：300℃；脫溶劑氣流量：7L/min。

（4）數(shù)據(jù)處理。花色苷含量采用峰面積表示法，以色譜圖中花色苷響應(yīng)峰面積值表征花色苷含量，進(jìn)行同種花色苷含量的比較。

結(jié)果與討論

檢測(cè)方法考察。花色苷為極性化合物，溶于極性溶劑，在低pH下保持相對(duì)穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選用CAPCELL PAK C18 ACR色譜柱，乙腈、水混合液（磷酸調(diào)pH=1.5）作為流動(dòng)相可對(duì)花色苷進(jìn)行較好分離錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)工作液與葡萄酒樣品色譜圖如圖1及圖2所示。

（1）線性范圍和靈敏度。選取0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L的錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“1.2.2色譜條件” 進(jìn)行測(cè)定，繪制樣品濃度（橫坐標(biāo)x，mg/L）與峰面積（縱坐標(biāo)y，mAU*min）標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，且當(dāng)信噪比為3（S/N=3）時(shí)，錦葵色素3-O-葡萄糖苷最低檢出限（LOD）為0.2mg/L，回歸方程為y=1.8183x + 0.5919，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9999。結(jié)果表明，該方法在本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)線性范圍內(nèi)，線性良好。

（2）樣品加標(biāo)回收率和精密度。在空白葡萄酒樣品中添加5mg/L、20mg/L、50mg/L錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)工作溶液，渦旋混合放置20min，按進(jìn)行前處理操作后，按“色譜條件”進(jìn)樣測(cè)定，以濃度值計(jì)算加標(biāo)回收率。為得到錦葵色素3-O-葡萄糖苷測(cè)定方法的精密度，試驗(yàn)對(duì)每一添加濃度樣品重復(fù)測(cè)定8次。各花色苷的加標(biāo)回收率在97.18%-98.27%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏（RSD） 在0.31%～0.94%。方法的回收率和重現(xiàn)性均較好。結(jié)果表明，該方法可對(duì)葡萄中花色苷進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，適用于本實(shí)驗(yàn)。endprint

釀酒葡萄果皮中花色苷變化。

（1）釀酒葡萄果皮中主要花色苷種類(lèi)。本實(shí)驗(yàn)在葡萄轉(zhuǎn)色過(guò)程中，使用“色譜條件”對(duì)三種釀酒葡萄中花色苷進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果與葡萄與葡萄酒中花色苷HPLC-MS/MS的分子離子與碎片離子峰譜庫(kù)信息進(jìn)行比對(duì)，完全成熟后的三種葡萄色譜圖如圖3所示。由圖可明顯看出，在成熟后（第10周）釀酒葡萄中，可明顯檢測(cè)到10種花色苷，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2所示。

與譜庫(kù)信息對(duì)比，實(shí)驗(yàn)檢出10種花色苷，主要為5種花色苷的單葡萄糖苷和它們相應(yīng)的衍生物，其中5個(gè)花色苷單體、3個(gè)?；ㄉ蘸?個(gè)其它花色苷，5個(gè)花色苷單體分別是飛燕草色素、矢車(chē)菊色素、牽?；ㄉ亍⑸炙幧?、錦葵色素單體葡萄糖苷。相應(yīng)峰l，2、3、4和5。5個(gè)花色苷單體的分子離子峰m/z分別為465、449、479、463和493，碎片離子峰m/z分別是303、287、317、301和331。其中，測(cè)得錦葵色素葡萄糖苷（峰5）在三種釀酒葡萄中響應(yīng)面積最大，含量最高，是檢測(cè)葡萄的第一特征花色苷。3個(gè)?；ㄉ障鄳?yīng)峰是7、8和10。經(jīng)檢測(cè)知其為矢車(chē)菊色素、牽?；ㄉ丶板\葵色素花色苷的第一衍生乙?；咸烟擒?，它們的分子離子峰m/z 分別為491、521和535，碎片離子峰m/z分別為287、317和331。其中錦葵色素的乙酰化糖苷（峰10）的含量較高。此外還檢測(cè)到4-丙酮基錦葵色素葡萄糖苷（峰6）與4-乙烯基芍藥色素葡萄糖苷（峰9），其分子離子峰m/z 分別為561、625，碎片離子峰m/z分別為399、331。

轉(zhuǎn)色前對(duì)三種釀酒葡萄果皮花色苷檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，葡萄果皮中不包含任何花色苷，葡萄呈現(xiàn)青綠色。轉(zhuǎn)色前期，葡萄呈現(xiàn)淡紫色，果皮中花色苷主要為5種單體花色苷，其中錦葵色素含量最高。隨著轉(zhuǎn)色的進(jìn)行，葡萄顏色不斷加深，最后呈現(xiàn)紫紅色。此時(shí)，葡萄果皮中花色苷種類(lèi)繁多，為5種單體花色苷與其他物質(zhì)反應(yīng)生成的衍生花色苷，包括乙?；ㄉ铡⑾愣辊；ㄉ?、咖啡?；ㄉ盏取１緦?shí)驗(yàn)中檢測(cè)到三種釀酒葡萄成熟后果皮花色苷以單體花色苷、乙酰化花色苷為主。

（2）總量變化。以中所檢測(cè)到的10種花色苷作為研究對(duì)象，以個(gè)花色苷峰面積作為定量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)三種釀酒葡萄在轉(zhuǎn)色過(guò)程中總花色苷變化趨勢(shì)進(jìn)行研究，總花色苷變化趨勢(shì)圖如圖4所示。

由圖4可以得知，三種釀酒葡萄中花色苷總量呈先上升，后趨于平緩，略有下降的趨勢(shì)。其中，1～5周花色苷總量變化緩慢，5～8周三種釀酒葡萄中花色苷總量均顯著增加，8周以后，花色苷總量趨于穩(wěn)定，赤霞珠略有降低。三種釀酒葡萄中，西拉中花色苷含量總量最高（552.24mAU*min），赤霞珠與品麗珠中花色苷總量差異不大，最大響應(yīng)面積值分別為367.96mAU*min、389.05mAU*min。赤霞珠中花色苷積累早于其它兩種葡萄，西拉次之。這種現(xiàn)象可能是由葡萄品種間差異所導(dǎo)致。

（3）釀酒葡萄果皮花色苷種類(lèi)及變化。對(duì)釀酒葡萄中10種花色苷進(jìn)行分類(lèi)分析，可分為單體花色苷類(lèi)、乙?；ㄉ疹?lèi)與其它花色苷類(lèi)三類(lèi)。3種釀酒葡萄中三類(lèi)花色苷在轉(zhuǎn)色過(guò)程中含量變化趨勢(shì)如圖5所示。

由圖5可以看出，三種釀酒葡萄中均含三類(lèi)花色苷，其中，單體花色苷含量最高，赤霞珠、品麗珠、西拉中單體花色苷最高含量響應(yīng)面積分別為284.31mAU*min、262.85mAU*min、381.21mAU*min。單體花色苷積累較早，但不同品種釀酒葡萄單體花色苷合成時(shí)間有所差異，赤霞珠、西拉在轉(zhuǎn)色第3周起，單體花色苷大量生成，而品麗珠中單體花色苷在轉(zhuǎn)色第4周起開(kāi)始大量積累。赤霞珠、西拉中單體花色苷在轉(zhuǎn)色第8周時(shí)相應(yīng)面積達(dá)到最大值，隨后含量有所降低，這是由于轉(zhuǎn)色第8周后，赤霞珠與西拉完全成熟，葡萄中單體花色苷不再或很少合成，又由于單體花色苷的不穩(wěn)定性，很容易與葡萄中其他物質(zhì)反應(yīng)生成新的衍生花色苷或其他不顯色物質(zhì)，因此單體花色苷含量有所下降。品麗珠單體花色苷積累晚于赤霞珠及西拉，轉(zhuǎn)色至第9周時(shí)單體花色苷并未達(dá)到最大值，可能是由于品種差異性導(dǎo)致品麗珠成熟晚于赤霞珠與西拉。

三種葡萄中乙酰化花色苷及其他花色苷合成均晚于單體花色苷，且含量遠(yuǎn)低于單體花色苷，赤霞珠、品麗珠、西拉中乙?；ㄉ兆罡吆糠謩e為75.64mAU*min、96.83mAU*min、160.90mAU*min。原因可能是乙?；ㄉ蘸铣墒軉误w花色苷及葡萄中代謝產(chǎn)物含量的制約。

其它花色苷包括很多種類(lèi)，本實(shí)驗(yàn)中，選擇含量較高的4-丙酮基錦葵色素-3-O-葡萄糖苷與4-乙烯基芍藥色素-3-O-葡萄糖苷作為研究對(duì)象。由圖5可以看出，三種葡萄中其它花色苷積累晚于乙?；ㄉ?，且含量較少。整個(gè)轉(zhuǎn)色過(guò)程中，其它花色苷含量變化不大，說(shuō)明其穩(wěn)定性較好

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用高效液相色譜儀，采用CAPCELL PAK C18 ACR色譜柱，乙腈-水（磷酸調(diào)pH值為1.5）溶液作為流動(dòng)相，使用紫外檢測(cè)器在檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm條件下對(duì)赤霞珠、品麗珠、西拉在轉(zhuǎn)色期間果皮中花色苷進(jìn)行檢測(cè)，使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)檢測(cè)到的各花色苷進(jìn)行定性，總結(jié)分析了三種釀酒葡萄在轉(zhuǎn)色期間果皮中花色苷種類(lèi)及含量的變化趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)色期間釀酒葡萄中花色苷種類(lèi)及含量均顯著增多，單體花色苷合成較早，但不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)化成其他花色苷。在葡萄完全成熟后，花色苷總量有所下降，單體花色苷含量明顯降低，乙酰化花色苷及其他花色苷性質(zhì)較為穩(wěn)定，其總量相對(duì)保持不變。

作者簡(jiǎn)介：

閆衡（1989-），女，漢族，陜西漢中，碩士研究生，助教，漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，研究方向：葡萄酒色澤研究、食品安全監(jiān)測(cè)；高娟（1989-），女，漢族，甘肅永昌，本科，助理工程師，單位：甘肅省金昌市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，研究方向：食品安全質(zhì)量控制。endprint