干酪乳桿菌胞外多糖的單糖組成分析

王宗瑩

立題背景

干酪乳桿菌作為益生菌的一種，能夠耐受有機體的防御機制，其中包括胃液中低pH值、口腔中的酶和小腸的膽汁酸等。所以干酪乳桿菌進入人體后可以在腸道內大量存活，起到促進人體消化吸收、調節腸內菌群平衡等作用 。

目前已知乳酸菌發揮主要生理功能特性的機理，除了主要代謝產物（如乳酸等）改善腸道內環境外，乳酸菌的次生代謝產物如細菌素、SOD、胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）等也具有重要的作用。乳酸菌胞外多糖（LAB EPS）即是這類細菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的粘液或夾膜多糖。自20世紀40年代成功開發出由腸明串珠菌發酵產生右旋糖酐以來，新的微生物胞外多糖的研究與開發在世界范圍內已成為研究的熱點。而乳酸菌胞外多糖因具有理論和實際應用價值已經引起了許多學者的興趣。許多乳酸菌是歷史悠久的工業生產菌，乳酸菌EPS不僅對乳制品的質構和風味具有重要影響，而且有可能成為食品級多糖的一個極好的來源而廣泛應用于各種食品的增稠、乳化、穩定、膠凝及保濕。

干酪乳桿菌

干酪乳桿菌的生長特性。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），是革蘭氏陽性菌，不產芽孢，不運動，無鞭毛，兼性異型發酵乳糖，不液化明膠；最適生長溫度為37℃；菌體兩端呈方形，長短不一，常成鏈；菌落粗糙，灰白色，有時呈微黃色，能發酵多種糖。干酪乳桿菌存在于人的腸道、口腔內含物和大便及陰道中，也常常出現在牛奶和飼料、乳制品、面團、干酪和垃圾中。

干酪乳桿菌的生理功能。（1）抗菌作用。研究表明，干酪乳桿菌不僅對很多細菌有拮抗作用，有的菌株還可以抑制酵母及霉菌的生長。Nemcova等報道L.paracasei可顯著降低剛斷奶幼豬體內梭菌屬和腸桿菌的數量；雷虹等值乳酸菌發酵泡菜液中分離得到的干酪乳桿菌HD1-7對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、沙門氏菌等很多致病菌均有抑制作用。

（2）免疫作用。研究表明，干酪乳桿菌可增強宿主對微生物病原體的非特異性抵抗力，加快腸道內病原體的清除，能夠改善腸道菌群紊亂和腸道通透性增強等，從而防止食物過敏和急性腹瀉，使抗低密度氧化脂抗體和CD4T-淋巴細胞增加，粒細胞的噬菌作用明顯增強，對宿主進行免疫調節，防止腫瘤的產生。

多糖及其結構

多糖。多糖屬于碳水化合物的一種，是由10個以上單糖分子通過糖苷鍵縮合而成的高聚物。多糖不是一種純粹的化學物質，而是聚合程度不同的物質的混合物。多糖類一般無甜味，不溶于水，不能形成結晶，無變旋現象和還原性。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解過程中，往往產生一系列的中間產物，最終完全水解得到單糖。

目前在多糖一級結構的分析中大多采用化學方法與物理方法相結合，可基本闡明某一多糖的一級結構的大致特征。而目前用于多糖高級結構分析的方法主要是物理方法， 諸如核磁共振、X-射線纖維衍射、電子衍射等。綜上所述，多糖的一級結構本身就很復雜。由于多糖結構的微觀不均一性， 或分子量分散， 或是結構鍵中有缺陷，使多糖的一級結構分析難以得出完全正確的結構式。

多糖結構。多糖的結構層次與蛋白質基本相似，分為一級、二級、三級和四級。其中，一級結構變化較大，研究較為成熟，到目前為止，已經建立的分析方法主要有物理法、化學法和生物法，例如，高碘酸氧化、甲基化反應、Smit11降解、酸水解、高效液相色譜法（HPLC）、質譜法（MS）、氣相色譜法（GC） 、核磁共振譜法（NMR）、紅外光譜法（IR）、酶化學方法等[7]；二、三、四級結構又合稱為高級結構（又稱高級構象），在很大程度上取決于一級結構，對其研究較為困難，目前多糖的立體結構研究一般靠 2D-NMR及X-衍射法，除了常見的這幾類技術手段外，多處于探索階段。除此之外， 多糖的活性還與溶解度、分子量、粘度等理化性質有關。在研究多糖的構效關系時， 常用到多糖的分子修飾， 對多糖進行化學修飾，如硫酸化、化學降解、烷基化、脫硫酸化、乙酰化、酶降解等等， 有助于深入探討其構效關系。

多糖的結構常因單糖構型、糖基化方式、輕基取代情祝、分支度、相鄰單糖基糖鏈位置的不同而不同，其結構的多變性使其成為生物體內重要的信息載體。多糖結構描述通常包括單糖組成、單糖構型、分子量范圍、糖昔鍵構型、重復單元、連接位點，甚至是空間構型。

對于分子量較大的多糖，對其結構研究大多停留在一級結構層面，現目前往往不能得到令人滿意的結果，因此，探索更為有力的研究手段成為今后發展的重要方向。

多糖結構的描述包括： ①多糖的分子量范圍；②多糖的單糖組分；③單糖的連接點類型；④單糖和糖苷鍵的構型；⑤重復單位。

干酪乳桿菌胞外多糖

胞外多糖 （Exopolysaccharides ， EPS ）是由細菌和微型藻類在生長過程中分泌到細胞外的長鏈多糖，廣泛產生于細菌與少數酵母菌及絲狀真菌中。在自然環境中，EPS通常具有保護微生物細胞的作用，如受噬菌體侵染，避免細胞干燥脫水，還可穩定滲透壓，參與細胞信息傳遞和細胞構成等。EPS常常以莢膜多糖和薪多糖兩種形式存在，但對于微生物來說，主要是指小與細胞表面永久粘附的黏多糖[8]。

乳酸菌能分泌多糖于細胞外，形成莢膜多糖粘附于細胞表面或以粘質多糖形式存在于細胞周邊培養基中，其形成有利于改善產品的質地和黏度。目前報道的產胞外多糖的主要的乳桿菌菌株有德氏保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、開菲爾乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌和清酒乳桿菌等。

產生胞外多糖的條件不一定是菌株的最佳生長條件。一些研究表明，在不同于干乳桿菌最適生長條件下接種，可以促進胞外多糖產量增加。GASSEM M A等認為，較低的接種溫度將導致活菌數量緩慢增加，有利于延長穩定期和對數期，從而有利于胞外多糖的形成。實驗表明干酪乳桿菌在葡萄糖添加量為4.68%，pH值為3.2，發酵時間為27.51h的條件下能夠形成較高產量的胞外多糖聚合物。endprint

干酪乳桿菌胞外多糖結構的鑒定

多糖結構的鑒定一般采用化學方法和波譜分析。化學方法主要包括酸解、甲基化、Smith降解過碘酸氧化等。波譜分析包括紅外吸收光譜、質譜、核磁共振氫譜（1H NMR ）、二維核磁共振（2D NMR） 、核磁共振碳譜（13C NMR ）和X射線衍射法等。

對EPS進行結構分析時多采用以下幾種方法：經過完全的或部分水解后，將單糖或寡糖乙酰化衍生化，通過HPLC或GC-MS方法檢測單糖組成；采用甲基化法測定糖連接位置，通過各甲基化物之間的比例，還可以推斷出糖鏈重復單元中各種單糖的數目；糖并鍵構型的確定方法有酶解法、分子旋光差法、紅外法、核磁共振法等，其中目前最常用的是核磁共振法；糖的氧環確定方法有13C NMR法、1H NMR法、甲醇解法、紅外法、Smith降解法等。

研究內容

測定胞外多糖的總糖含量和蛋白質含量，重點分析多糖中單糖組成及其比例。主要利用紫外分光光度法，凝膠色譜法和氣相色譜質譜分析法。

材料與設備

干酪乳桿菌胞外多糖。

干酪乳桿菌胞外多糖樣品由實驗室提供。

試劑。

單糖標準品（葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖），苯酚，濃硫酸，酪蛋白，考馬斯亮藍，乙醇，磷酸，三氟乙酸，甲醇，硼氫化鈉，乙酸酐，吡啶，氯仿。

儀器與設備。

電熱恒溫培養箱DHP-9082 上海一恒科學儀器有限公司

DELTA 320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司

分析天平XP205 瑞士梅特勒-托利多公司

紫外可見分光光度計UV-2550 日本島津公司

氣相色譜-質譜聯用儀（Agillent 6890-5973色譜系統，色譜柱DB-5 （60m×0.25mm×0.20μm））。

凝膠色譜柱及檢測器（色譜柱為Agilent PL aquagel-OH mixed柱（300mm×7.5mm，i.d.8?m），示差折光檢測器）。

實驗方法

單糖的含量總量測定。

（1）標準曲線的制作。準確稱取葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6及0.4ml，各以蒸餾水補至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml，搖勻冷卻，室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標為多糖微克數，縱坐標為光密度值，得標準曲線。

（2）樣品的測定。吸取2 ml的樣品液，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml，搖勻冷卻室溫放置20分鐘以后于490nm測光密度。

總糖%=測得總糖含量/樣品總量×100%

蛋白質含量的測定。

（1）酪蛋白標準溶液的制備與保存

取0.1mg/ml的酪蛋白標準溶液，4.0℃～5.0℃冰箱中保存。

（2）考馬斯亮藍G-250溶液的制備

精密稱取考馬斯亮藍G-250 100.00mg加入95%乙醇50ml，再加入85%磷酸100ml，然后用蒸餾水定容至1000ml。最終試劑為含0.01%考馬斯亮藍G-250，4.7%乙醇，8.5%磷酸，置于棕色瓶中備用。

（3）樣品的制備

精確稱取干酪乳桿菌胞外多糖100.00mg加蒸餾水溶解定容至100ml，即為1mg/ml樣品溶液。

（4）標準曲線的制備

分別精密吸取標準蛋白質溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0ml于10ml試管中，各管加水調整至1ml，加入已配置好的考馬斯亮藍G-250溶液5ml，混勻，放置10min，以空白試劑參比，于595nm處測定其吸光度。并記錄且繪制標準曲線。

（5）樣品中蛋白質含量的測定

取樣品溶液各1ml，同時做三個重復，以空白試劑為參比，按上述標準曲線的測定法，分別測定他們吸光度值，計算樣品中蛋白質的含量。

凝膠色譜分析多糖中單糖構成。

（1）干酪乳桿菌胞外多糖的水解。精確稱取1份干酪乳桿菌胞外多糖20. 0mg于試劑瓶中，加入2.0 mol/ L TFA 5ml，封管，置于110 ℃烘箱內進行水解，水解時間分別為8h。冷卻至室溫，將水解液低于50℃減壓蒸干，然后加入甲醇蒸干，備用。

（2）色譜條件。色譜柱為Agilent PL aquagel-OH mixed柱（300mm×7.5mm，i .d . 8?m）， 柱溫30℃；流動相為水，流速1mL/min；進樣量50?L；示差折光檢測器，檢測溫度35℃。

GC-MS法分析多糖的單糖組成。

（1）樣品衍生化。取多糖水解樣品，溶于2 mL蒸餾水中，加入硼氫化鈉，還原反應2 h，蒸干；將還原后的糖醇置于110 ℃烘箱中加熱，加入乙酸酐和吡啶，100 ℃反應1 h，蒸干。將乙酰化的產物用4 mL氯仿溶解后過濾，上機。

（2）色譜條件。程序升溫條件： 初始溫度200℃ ； 以25℃/min，升溫至250℃，保持11min。色譜柱： DB-5 （60m×0.25mm×0.20μm）Agillent 6890-5973氣相色譜-質譜聯用儀；進樣口：250℃；離子源： EI；四級桿溫度：150℃；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；載氣：He；進樣模式：splitless ；流速：1ml/min；電離方式：EI，70eV；質量掃描范圍：50～550 amu

結果與討論

單糖含量的測定。endprint

（1）葡萄糖標準曲線的制備

（2）樣品結果測定及分析

測得樣品OD值為0.998

該干酪乳桿菌胞外多糖總糖百分含量

=（184.296÷2÷1000）/0.1×100%

= 92.148%

由實驗數據可知 該干酪乳桿菌中含有糖類總量為92.148%，符合標準要求。對其雜項本文并未作出細致分析，將留待下次試驗解決。但通過該實驗可以說明，該干酪乳桿菌胞外多糖中不僅僅含有糖類物質，同時也含有其他待確認物質。

蛋白質含量的測定。

（1）酪蛋白標準曲線的制備

得其線性回歸方程式A= 0.0081C-0.0739 R2=0.9962 相關系數r=0.9980 表明蛋白質在10?g/ml～100 ?g/ml 范圍內很好地符合朗伯-比爾（Lamber-Beer）定律。

（2）樣品蛋白質含量測定結果

按上述蛋白質含量測定方法，同時做三個重復試驗，經測定吸光度值分別為0.459 ，0.458 ，0.441，計算得干酪乳桿菌胞外多糖中蛋白質含量分別為6.58% ，6.57%，6.37%，平均含量為6.51%。

凝膠色譜分析多糖中單糖構成。

凝膠色譜圖譜如圖3所示。

通過分析發現，該多糖樣品中主要有5種單糖組分。但在5.0-8.0ml范圍內時，峰型較寬且出峰較緩，分析結果不十分明顯，預計分析為在此情況下仍有組分未被分解出來。但由于實驗時間條件有限，故僅作此粗略分析。

GC-MS法分析多糖的單糖組成。

干酪乳桿菌胞外多糖的單糖構成氣質圖譜如下圖。圖4為單糖混標圖譜，圖5為樣品圖譜。

通過GC-MS分析結果可知：干酪乳桿菌胞外多糖主要由阿拉伯糖，木糖，甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖等6種單糖組成。當然不排除該糖樣品中還包括有其他糖類物質，因為實驗條件及時間有限，對于氣相色譜的實驗要求也非常高，故而該實驗不能一次完成更多糖樣品的測定。根據文獻，在乳酸菌胞外多糖結構中最常見的有甘露糖，鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖7種單糖。分析如下：

由上表可知，在本實驗中測得，干酪乳桿菌胞外多糖中主要含有六種單糖，分別是阿拉伯糖，木糖，甘露糖，葡萄糖，鼠李糖和半乳糖。其中以甘露糖，半乳糖和葡萄糖的含量較多。六種單糖的含量比為葡萄糖：甘露糖：鼠李糖：半乳糖：阿拉伯糖：木糖=1.0000：3.4249：0.0670：1.6030：0.6326：0.2150。

經分析，干酪乳桿菌胞外多糖凍干樣品中總糖含量為92.148%（以葡萄糖計），蛋白質含量為6.51%，該多糖由阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6種單糖組成，六種單糖的含量比依次為葡萄糖：甘露糖：鼠李糖：半乳糖：阿拉伯糖：木糖=1.0000：3.4249：0.0670：1.6030：0.6326：0.2150.

本實驗僅對干酪乳桿菌胞外多糖的一級結構進行了分析，且分析并不完善，有待進一步研究，接下來可以探索通過陰離子液相色譜，氣相色譜，薄層分析等方法對干酪乳桿菌胞外多糖進行結構分析，以增強對干酪乳桿菌胞外多糖的了解，并通過此對乳酸菌胞外多糖的結構開始進行進一步的探索。endprint