雄激素合成酶在H22荷瘤小鼠不同證候表達差異?

潘志強，方肇勤，盧文麗，劉小美，梁 超，張園園

(上海中醫藥大學基礎醫學院,上海 201203)

【實驗研究】

雄激素合成酶在H22荷瘤小鼠不同證候表達差異?

潘志強，方肇勤△，盧文麗，劉小美，梁 超，張園園

(上海中醫藥大學基礎醫學院,上海 201203)

目的：研究睪丸雄激素合成酶與腫瘤狀態下小鼠證候的關系。方法：采用實驗小鼠及其標準化四診與辨證方法篩選H22荷瘤小鼠邪毒壅盛證、氣虛證、陽氣虛證、氣陰陽虛證，并以GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array技術檢測睪丸組織基因芯片表達譜，重點分析睪丸基因芯片中雄激素合成酶及其調節因子在不同證候小鼠中的差異表達。結果：與正常組比較，Star、Stard5、Cyp17a1、Hsd3b6、Hsd17b3、Sult1e1等基因在早期邪毒壅盛證和氣虛證小鼠呈現下調趨勢，且在中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證下調幅度更加顯著，Cyp11a1、Hsd3b1、Hsd17b10、Hsd17b11、Hsd17b12、Fdx1、Fdxr、Por、Sult1a1等僅在中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證中顯著下調，Cyp17a1僅在睪丸組織特異性中表達。結論：H22荷瘤小鼠腫瘤形成后，自發產生的虛證越嚴重，其睪丸雄激素合成酶基因轉錄活性越低。

雄激素合成酶；證候；小鼠；基因芯片；基因表達

證候的發生涉及神經內分泌免疫網絡功能紊亂的觀點在中醫學術界基本達成共識。既往在臨床與實驗動物方面均發現，虛證在下丘腦、垂體、腎上腺皮質、甲狀腺、性腺、胸腺等存在功能紊亂現象[1-3]。方肇勤課題組以H22肝癌荷瘤小鼠為實驗對象，采用小鼠標準化四診與辨證技術，動態觀察荷瘤小鼠不同階段自然形成的證候演變及檢測神經內分泌免疫組織的基因表達譜，發現不同證候具有特征性差異表達基因[4]。

本文在課題組既往H22肝癌荷瘤小鼠不同證候睪丸基因芯片數據基礎上[5-7]，深入分析雄激素合成酶及其調節因子在不同證候中的表達特征，發現隨腫瘤的進展，中晚期小鼠腫瘤體積逐漸增大，氣血陰陽虛證日益嚴重，呈現典型的虛實夾雜證候特征，相應的雄激素合成減弱，其雄激素合成酶與調控因子的基因表達逐漸減弱，提示這可能與中晚期腫瘤虛證的發生有關，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

昆明種雄性小鼠250只，體質量(25±1)g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供(動物生產許可證號SCXK(滬)2003-0003)。

1.2 實驗試劑

TRIzol試劑購自美國GIBCO BRC公司，RNeasy Mini Kit試劑盒購自德國QIAGEN公司，RNA 6000 Nano LabChip購自美國Agilent Technologies公司，小鼠外顯子基因芯片(GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array)及其試劑盒購自美國Affymetrix公司。

1.3 實驗儀器

1.3.1 四診計量化檢測設備 YLS-13 A型小鼠抓力測定儀(購自山東省醫學科學院設備站)用于抓力檢測，底部劃有4.5 cm×5.5 cm方格(3行×6列=18格)的實驗籠用于曠場檢測，NIKON 4500數碼相機用于顯微和普通拍照、曠場檢測錄像，3200 K(色溫)250 W攝像專用光源顯微和普通照明，MP200B型電子天平(購自上海恒平科學儀器有限公司)用于動物和飼料稱質量，數字WMY-01型溫度計(購自上海華辰醫用儀表有限公司)用于檢測腋溫，SQF-EA體視顯微鏡(購自上海萬科儀器有限公司)用于顯微爪、尾的顯微拍攝，游標卡尺、個人電腦用于圖像和數據處理。

1.3.2 芯片檢測儀器 雜交爐、芯片洗滌系統和芯片掃描儀等購自美國Affymetrix公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及處理 采用隨機數字表法取60只做正常對照，另190只腋下接種H22腫瘤腹水癌細胞0.2 ml(細胞濃度4×107/ml)，出瘤后淘汰40只出瘤不佳及畸形小鼠，剩余150只。取正常小鼠20只和肝癌小鼠150只用于四診計量檢測和辨證，另40只正常對照小鼠不做四診檢測(用于早期、中期的正常對照組)，常規飼養。

1.4.2 四診計量化檢測方法與計量辨證方法 我們采用課題組研制的小鼠四診工作站技術與方法標準采集小鼠四診信息，主要包括小鼠一般外觀表現、體質量、體溫、飲水量、攝食量、曠場實驗小鼠跨格數、小鼠肢體抓力、爪色澤、尾色澤、腫瘤瘤徑等指標，然后進行計量化辨證，可參見有關文獻[8]。

1.4.3 肝癌小鼠分期與常見證候的確定 H22肝癌小鼠分期標準參見有關文獻[9]。分別于接種腫瘤后第7天(早期)、第20天(中期)、第28天(中晚期)進行全體小鼠四診檢測與辨證，并分別于檢測后的次日，即接種腫瘤后第8天(早期)辨證并篩選出最為典型的邪毒壅盛證和氣虛證小鼠各16只，第21天(中期)辨證并篩選出最為典型的陽氣虛證小鼠16只，第29天(中晚期)辨證并篩選出最為典型的氣陰陽虛證小鼠16只。

1.4.4 不同證候肝癌小鼠的處死與取材 在小鼠四診檢測與辨證的次日，即分別于接種腫瘤后第8天處死邪毒壅盛、氣虛證肝癌小鼠以及正常對照小鼠各16只；第21天處死陽氣虛肝癌小鼠和正常對照小鼠各16只，第29天處死氣陰陽虛肝癌小鼠和正常對照小鼠各16只。分別取下丘腦、垂體、甲狀腺、腎上腺、睪丸、胸腺、脾臟和腫瘤組織。

1.4.5 RNA的提取與檢測 以上共5組樣本采用Trizol(GIBCO BRC)試劑盒及其方法，抽提睪丸組織總RNA；采用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)試劑盒及其方法純化RNA；采用RNA Nano LabChip和方法，及其配套的Agilent-bioanalizer 2100檢測RNA的質量和電泳圖譜。

1.4.6 芯片檢測 采用Affymetrix的GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其試劑盒所建議的檢測方法。依據檢測結果和Affymetrix建議的方法，采用iterPlier法計算核心基因表達讀數值。以上RNA質量和芯片檢測委托上海生物芯片有限公司完成。

1.4.7 雄激素合成酶及其調節因子的基因篩選 在睪丸基因芯片原始數據中，篩選雄激素合成酶及其調節因子，并以正常組為對照，計算不同證候差異變化倍數，即各證候/正常基因芯片讀數比值。

2 結果

2.1 雄激素合成起始環節相關轉運蛋白在荷瘤小鼠不同證候中的表達差異

表1顯示，雄激素合成起始環節由類固醇急性調節蛋白(Star)介導，將細胞漿內膽固醇從線粒體外膜轉運到線粒體內膜。此外，協同轉運的StarD家族蛋白也起到類似馬達蛋白作用，為類固醇激素合成提供重要的膽固醇原料，其中StarD4和StarD5具有低水平Star活性作用，而StarD6主要表達于生精細胞，但其功能不清楚。結果顯示，H22荷瘤小鼠腫瘤發生后，早期邪毒壅盛證和氣虛證睪丸Star基因表達下調40%，中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證Star基因表達下調達60%，同樣，Stard4、Stard5、Stard7和Stard8基因在陽氣虛證和氣陰陽虛證也下調，提示中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證H22荷瘤小鼠睪丸雄激素合成的起始環節就出現異常。此外，Stard10基因在睪丸組織中表達量非常高，但是其在睪丸中的生物功能尚不清楚。

2.2 雄激素合成限速酶和17α羥化酶在荷瘤小鼠不同證候中的表達差異

表2顯示，Cyp11a1編碼膽固醇側鏈裂解酶P450scc，主要催化膽固醇轉化為孕烯醇酮，是類固醇合成過程的限速酶。結果顯示，在中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證Cyp11a1表達下調60%，提示中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證H22荷瘤小鼠睪丸雄激素合成起始環節限速過程顯著降低。P450c17酶既有17α羥化酶活性，又表現出17,20裂解酶活性，將孕烯醇酮轉化為C19類固醇(脫氫表雄酮)。結果顯示，不同證候均出現Cyp17a1基因表達下調，尤其是中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證Cyp17a1表達下調約60%，提示中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證H22荷瘤小鼠睪丸雄激素前體轉化為脫氫表雄酮的能力顯著降低。

表1 膽固醇轉運相關分子在不同證候中的基因表達差異

表2 雄激素合成限速酶和17α羥化酶在不同證候中的表達差異

2.3 羥基類固醇脫氫酶在荷瘤小鼠不同證候中的表達差異

2.3.1 3β-羥基類固醇脫氫酶 表3顯示，3β-HSDs主要作用催化孕烯醇酮轉化為孕酮、17羥-孕烯醇酮轉化為17羥-孕酮、脫氫表雄酮(DHEA)轉化為雄烯二酮、雄烯二醇轉化為睪酮。結果顯示，小鼠睪丸組織Hsd3b1和Hsd3b6高表達，各證候Hsd3bs基因表達均下調，尤其是中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證Hsd3b3、Hsd3b6基因下調約70%，提示中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證小鼠雄激素合成過程的脫氫酶活躍性下降。

表3 3β-羥基類固醇脫氫酶在不同證候中的表達差異

2.3.2 11β-羥基類固醇脫氫酶 表4顯示，11β-HSDs屬于短鏈脫氫酶還原酶(SDR)家族，包括Hsd11b1和Hsd11b2。結果顯示，它們在小鼠睪丸組織中表達量較低，提示它們對睪丸生理功能不重要。

表4 11β-羥基類固醇脫氫酶在不同證候中的表達差異

2.3.3 17β-羥基類固醇脫氫酶 表5顯示，17β-HSDs屬于醛酮還原酶(AKR)家族，它催化雄烯二酮轉化為睪酮、脫氫表雄酮轉化為雄烯二醇、雌酮轉化為雌二醇等重要生化過程。17β-HSDs包括多種亞型，其中Hsd17b3屬于微粒體氧化酶，它特異性表達于睪丸組織，該酶的紊亂常導致男性假兩性畸形(17-酮類固醇還原酶)缺陷。本研究結果顯示，H22荷瘤小鼠腫瘤形成后，不同證候小鼠睪丸Hsd17b3基因表達下調50%～70%，且中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證下調更顯著，提示嚴重的虛實夾雜證腫瘤小鼠睪丸雄激素合成與轉化關鍵酶活躍性下降。然而，Hsd17b1主要表達于胎盤組織和卵巢顆粒細胞，負責催化雌二醇生成；Hsd17b2屬于微粒體氧化酶，主要表達于胎盤、肝臟、小腸、前列腺、子宮內內膜和卵巢組織。本基因芯片未包含Hsd17b1和Hsd17b2轉錄本。 Hsd17b4類似Hsd17b2，Hsd17b4缺乏會引起Zellweger綜合征，結果顯示Hsd17b4在睪丸中表達量很高，且中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證Hsd17b4表達下調約10%；小鼠Hsd17b5(Akr1c6)最早克隆于3α羥基類固醇脫氫酶，屬于AKR酶，催化雄烯二酮轉化成睪酮，且在體外相當不穩定。目前認為，Hsd17b5在前列腺內雄激素代謝有重要作用，Hsd17b5在睪丸中表達量低，同樣在中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證Hsd17b5表達下調約40%。值得注意的是，Hsd17b6(別名Hsd17b9、Rdh8)、Hsd17b7、Hsd17b8、Hsd17b10、Hsd17b11、Hsd17b12、Hsd17b13等盡管屬于17βHSD家族，但實際上其17βHSD活性非常弱，它們與雄激素合成過程關系不大。結果顯示，睪丸組織中Hsd17b10、Hsd17b11、Hsd17b12表達量較高，且在中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證均下調30%以上。總體而言，H22荷瘤小鼠陽氣虛證和氣陰陽虛證17β羥基類固醇脫氫酶多種亞型基因表達均呈現下調趨勢，提示17βHSD酶活性下降可能與虛證關系密切。

表5 17β-羥基類固醇脫氫酶在不同證候中的表達差異

2.4 雄激素合成酶的調節因子在荷瘤小鼠不同證候中的表達差異

表6顯示，雄激素合成各酶的幾個重要調節因子，包括鐵氧還蛋白1(Fdx1)、鐵氧還蛋白還原酶(Fdxr)、P450氧化還原酶(Por)、5α還原酶(Srd5a)、細胞質磺酶(Sult)等，其中睪酮經5α還原酶(Srd5a1、Srd5a2)作用后轉化成更強烈的雙氫睪酮，類固醇的磺和硫酸化方式主要通過細胞質磺(Sult)酶作用，以產生活性更強的雄激素。結果顯示，小鼠睪丸Sult1e1和Sult1a1基因表達均高，Sult1e1在不同證候H22荷瘤小鼠均出現下調，尤其是中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證Fdx1、Fdxr、Por、Sult1e1和Sult1a1基因表達均下調，提示中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證H22荷瘤小鼠睪丸雄激素磺和硫酸化作用也顯著減弱。

表6 雄激素合成酶調節因子在不同證候中的表達差異

2.5 P450c17酶在小鼠睪丸組織特異性表達

表7顯示，P450c17酶主要表達于睪丸組織，依據芯片結果發現，Cyp17a1基因在正常小鼠睪丸中表達量非常高，芯片讀數值為8358，而正常小鼠下丘腦、垂體、腎上腺、甲狀腺、胸腺、脾臟組織表達量非常低，僅是睪丸組織的1.3%～6.7%。此外在腫瘤組織也低表達，進一步提示Cyp17a1基因在睪丸組織特異性表達的特性。

表7 Cyp17a1基因在小鼠不同組織中表達量比較

2.6 P450arom芳香化酶在小鼠各組織中的表達比較

表8顯示，P450arom芳香化酶由Cyp19a1基因編碼，是雌激素合成過程的關鍵酶，主要催化睪酮和雄烯二酮轉化為雌激素，Cyp19a1基因在雄性小鼠睪丸、下丘腦、垂體、腎上腺、甲狀腺、胸腺、脾臟、腫瘤等組織中表達量均非常低，提示Cyp19a1在雄激素合成過程中不重要。

3 討論

證候研究是中醫基礎理論的一個重要領域，近幾十年來，探索證候發生的物質基礎是中醫基礎現代化的方向之一。既往的研究思路是依據中醫證候產生的病理因素，在實驗動物上施加類似因素以復制不同證候模型，然后檢測模型動物相關靶組織的分子變化，以期望發現證候的可能物質基礎，這種方法被廣泛運用，其優點是方法易于采納與推廣，缺點是一些實施的造模因素與臨床疾病及證候發生不相符。近20年來，方肇勤課題組依據中醫臨床自然狀態下的辨證思維模式，發明與創建了小鼠/大鼠標準化四診信息采集方法與辨證技術[8-9]，針對疾病模型小鼠予以辨證分型，然后對同病異證小鼠神經內分泌免疫網絡組織及相應的病變組織進行微觀指標檢測，以期望揭示證候的可能物質基礎，該研究方法最大優點是符合臨床診治實際，運用中醫思維對任何疾病動物均可執行辨證論治，具有很強的實用性，然而部分學者對小鼠/大鼠標準化四診信息采集方法與辨證技術也有質疑。

表8 Cyp19a1基因在小鼠不同組織中表達量比較

證候是客觀存在的，那么證候是否具有相應的物質基礎？理論上是肯定的。但證候的物質基礎是否可用比較簡潔的語言表述清楚，目前依然難以定論甚至存在很大爭論[10]。經學術界的不斷研究與積累，發現證候與神經內分泌免疫網絡及其病變靶組織的內在變化存在一定的關系，這一認識在業界基本達成共識。基于此，本文主要從性腺合成雄激素重要功能基因的轉錄組層面，探索H22肝癌荷瘤小鼠自發形成的各種證候在雄激素合成轉錄組的變化。我們采用基因芯片技術檢測了正常小鼠以及不同證候荷瘤小鼠睪丸組織的基因表達，圍繞雄激素合成過程的重要酶及其調節因子，比較與分析它們在不同證候中的差異表達特征。業已明確[11-12]，睪酮及其前體去氫表雄酮(DHEA)是睪丸間質細胞合成的重要雄激素，其生化合成過程屬于類固醇激素。經典生化合成過程是，類固醇急性調節蛋白(StAR)首先將膽固醇從線粒體外膜轉運到線粒體內膜，然后在P450側鏈裂解酶作用下合成孕烯醇酮，這兩步是限速過程；之后經P450 17α羥化酶催化合成DHEA，再經3β羥基固醇脫氫酶的催化作用最終合成睪酮。

芯片結果顯示，雄激素合成過程重要酶包括Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1、Hsd17b3等在正常小鼠睪丸組織中表達非常高(芯片讀數2000以上，是睪丸基因芯片均值746的3倍以上)，尤其是Cyp17a1在睪丸組織呈現特異性高表達(芯片讀數值為8358)，Cyp19a1在雄性小鼠各組織中低表達，進一步佐證基因芯片數據的穩定性與可信度。進而深入分析各基因差異表達與不同證候的關系，發現雄激素合成起始環節的2個重要限速酶Star和Cyp11a1在中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證均下調60 %以上。此外，Stard4、Stard5、Stard7和Stard8基因在陽氣虛證和氣陰陽虛證也下調，提示中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證H22荷瘤小鼠睪丸間質細胞將膽固醇從線粒體外膜轉運到線粒體內膜的轉運能力下降，而Cyp11a1基因表達的下調進一步提示雄激素起始過程的限速步驟的合成能力明顯下降。同樣，不同證候均出現Cyp17a1基因表達下調，尤其是中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證Cyp17a1表達下調約60%，提示中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證H22荷瘤小鼠睪丸雄激素前體轉化為脫氫表雄酮的能力顯著降低。細胞色素P450是一類重要的酶，其中有7個表達于線粒體、50個表達于內質網，而15個內質網中P450酶是肝藥物代謝酶，20個參與類固醇激素和膽汁酸等合成，15個作用不明確。在睪丸間質細胞，Cyp11a1編碼膽固醇側鏈裂解酶P450scc，主要催化膽固醇轉化為孕烯醇酮，是類固醇合成過程的限速酶；Cyp17a1編碼P450c17酶，既有17α羥化酶活性、又表現出17,20裂解酶活性[13]。本研究顯示，小鼠腫瘤形成后，中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證的睪丸組織Cyp11a1和Cyp17a1基因表達顯著低于正常小鼠，說明中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證小鼠具有雄激素合成能力下降的特征。

此外，羥基類固醇脫氫酶家族成員、Hsd3bs基因在各證候中表達均下調，尤其是中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證Hsd3b3、Hsd3b6基因下調約70%；中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證荷瘤小鼠睪丸Hsd17b3、Hsd17b4、Hsd17b5、Hsd17b7、Hsd17b10、Hsd17b11基因表達明顯低于正常組小鼠。它們在睪酮合成過程中發揮重要的脫氫酶作用，提示小鼠腫瘤形成后，中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證小鼠睪酮合成與轉化能力顯著下降。而雄激素合成酶的重要調節因子Fdx1、Fdxr、Por、Sult1e1和Sult1a1在中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證表達也顯著下降，進一步提示其雄激素磺和硫酸化作用也顯著減弱。

綜上所述，昆明種小鼠接種H22肝癌細胞后，腫瘤形成后的不同階段自發出現邪毒壅盛證、氣虛證、陽氣虛證、氣陰陽虛證等證候，通過對不同證候睪丸組織的基因表達譜檢測，發現中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證小鼠睪丸雄激素合成過程關鍵酶及其調節因子基因轉錄明顯低于正常對照小鼠，提示雄激素合成酶轉錄水平下降可能是腫瘤小鼠中晚期陽氣虛證和氣陰陽虛證的重要特征性變化。

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DifferentialExpressionofAndrogenSynthaseinDifferentSyndromesofH22TumorBearingMice

PAN Zhi-qiang, FANG Zhao-qin△, LU Wen-li, LIU Xiao-mei, LIANG Chao, ZHANG Yuan-yuan

(BasicMedicalSchoolofShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai, 201203,China)

Objective: To study the relation of androgen synthases genes expression and syndromes in H22 tumor Mice. Methods: By the quantitative four diagnosis and syndrome differentiation methods, different H22 tumor mice with poisonous pathogenic factors syndrome and asthenia of qi syndrome in earlier period, asthenia of yang and qi syndrome on intermediate stage, asthenia of qi and yin and yang syndrome on advanced stage were obtained. Then testis cDNA microarray were detected by GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array. The androgen synthase and its regulatory factor genes expression were analyzed. Results: Compared with normal mice, Star, Stard5, Cyp17a1, Hsd3b6, Hsd17b3 and Sult1e1 genes expression were down-regulated in pathogenic factors syndrome and asthenia of qi syndrome on earlier period, and those genes were more significantly down-regulated in asthenia of yang and qi syndrome, asthenia of qi and yin and yang syndrome. Cyp11a1, Hsd3b1, Hsd17b10, Hsd17b11, Hsd17b12, Fdx1, Fdxr, Por and Sult1a1 genes expression were down-regulated only in asthenia of yang and qi syndrome, asthenia of qi and yin and yang syndrome. And Cyp17a1 specifically expressed only in testis. Conclusion: After the tumorigenesis, androgen synthases genes expression were decreased with spontaneous asthenia syndromes aggravation.

Androgen synthase; Syndrome; Mice; GeneChip; Genes expression

R285.5

B

1006-3250(2017)10-1379-05

上海市科委國際合作資助項目(064307052)-中醫藥有關腫瘤辨證論治機制的系統生物學研究；上海市進一步加快中醫藥事業發展三年行動計劃(2014～2016年)(ZY3-CCCX-3-3010)-溫腎壯陽中藥有效成分的類固醇激素樣效應比較及其相須配伍的物質基礎

潘志強(1977-)，男，江西人，教授，醫學博士，碩士研究生導師，從事實驗中醫學教學與中醫證候實驗研究。

△通訊作者：方肇勤(1955-)，男，上海人，醫學博士，教授，博士研究生導師，從事實驗中醫學教學與中醫基礎實驗研究，Tel：021-51322115，E-mail：zqfang@sh163.net。

2017-03-16