原發性膽汁性膽管炎的動物模型

郝 娟， 劉成海，2，3

(1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院 肝病研究所， 上海 201203； 2 上海市中醫臨床重點實驗室， 上海 201203；3 上海高校中醫內科學 E-研究院， 上海 201203)

原發性膽汁性膽管炎的動物模型

郝 娟1， 劉成海1，2，3

(1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院 肝病研究所， 上海 201203； 2 上海市中醫臨床重點實驗室， 上海 201203；3 上海高校中醫內科學 E-研究院， 上海 201203)

理想的原發性膽汁性膽管炎(PBC)動物模型對于研究疾病的病理生理機制與藥物研發等均有重要意義。近年來可反映血清抗線粒體抗體陽性與膽管免疫病理損傷等PBC特點的動物模型取得了較大進展。目前PBC動物模型的制備方式多樣，包括化學或生物染毒誘導，以及基因敲除后自發形成。但上述模型尚無法完全模擬人類PBC，其血清學、免疫學、組織病理等方面也各有特點，提示PBC基因特異與環境改變的病理機制的復雜性，對認識免疫耐受性被打破和膽管上皮細胞受到特異性攻擊等PBC早期事件的機制具有重要意義。

膽管炎， 膽汁性； 模型， 動物

原發性膽汁性膽管炎(PBC)是器官特異性自身免疫性疾病，其特征在于約95%的PBC患者血清高滴度抗線粒體抗體(AMA)和進行性門靜脈周圍淋巴細胞介導的膽管上皮細胞免疫性破壞[1]。PBC以中老年女性高發，但病因機制不清。目前，PBC診斷仍是一種排他性診斷方式，即具備以下3條標準中的2條：(1)存在膽汁淤積的生化學表現，如ALP水平升高；(2)血清抗線粒體抗體(AMA)或AMA-M2陽性；(3)肝組織病理顯示非化膿性膽管炎與小葉間膽管損傷[2]，這也透露出PBC的病理機制研究存在較多疑點和難點。動物模型是闡述人類疾病病因病理機制、開發治療藥物的重要工具。目前，幾種PBC的動物模型通過基因修飾或化學生物免疫誘導2種方式模擬PBC的血清學、免疫學或病理學特征。這些動物模型有助于剖析遺傳、環境因素在PBC發病中的作用，促進對PBC發病過程的理解，現分述如下。

1 基因修飾類模型

1.1 dnTGFβ RⅡ小鼠模型 TGFβ Ⅱ型受體顯性失活(dominant-negative transforming growth factor-β receptor type Ⅱ，dnTGFβ RⅡ)轉基因小鼠模型最初由R. A. Flavell開發，用于研究該受體在T淋巴細胞功能中的作用[3]。在CD4啟動子的控制下，dnTGFβ RⅡ轉基因小鼠過表達TGFβ受體Ⅱ型顯性抑制基因。

該模型的表型特征包括：(1)針對相同的線粒體自身抗原丙酮酸脫氫酶的E2亞基(the E2 subunits of pyruvate dehydrogenase，PDC-E2)、支鏈2-氧代酸脫氫酶(branched chain 2-oxo acid dehydrogenase，BCOADC-E2)，2-氧代-戊二酸脫氫酶(2-oxo-glutarate dehydrogenase，OGDC-E2)自發產生AMA，陽性率分別為100%、68%和95%；(2)含有AMA的血清能夠體外特異性抑制PDC-E2酶活性；(3)肝實質和門靜脈區有特異性巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，主要包括CD4+、CD8+、B淋巴細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)；(4)膽管上皮細胞破壞嚴重，有些甚至不能確定完整的膽管結構；(5)相似的血清細胞因子譜：血清中IFNγ、TNFα、IL-6和IL-12 p40水平均顯著增加[4](表1)。

dnTGFβ RⅡ小鼠模型不同于人類PBC的特點有：(1)發病無性別差異；(2)血清ALP無法測得；(3)肝內無嗜酸性粒細胞浸潤，肉芽腫形成也不明顯；(4)肝內CD3+淋巴細胞總數和比例均明顯增高；CD4+淋巴細胞總數有所增加，但比例增加不明顯；CD8+淋巴細胞總數和比例均有顯著升高；(5)免疫球蛋白以IgA升高為主[4]。

然而，同型對照dnTGFβRⅡRag1-/-小鼠血清中不能檢測到AMA，肝組織學顯示正常，無肝細胞或膽管特異性病理損傷證據[4]。可見，dnTGFβRⅡ是引發該模型病理機制的關鍵因素，TGFβRⅡ通路對PBC發病機制具有重要的提示作用。

TGFβ具有調節細胞增殖、分化和遷移等多種功能，在調節炎癥、傷口修復、免疫穩態和耐受性方面起著重要作用[5]。TGFβ缺乏可導致多種自身免疫性疾病，如自身免疫性膽管炎和結腸炎等。TGFβ受體Ⅱ對TGFβ信號轉導非常重要，可調節淋巴細胞的活化。顯性負性TGFβ受體是由CD4+和CD8+T淋巴細胞表達的，可引起TGFβ信號傳導大大降低，導致T淋巴細胞固有細胞介導的自身免疫反應[6]。為了進一步明確T淋巴細胞在PBC發病中的作用，將dnTGFβ RⅡ來源的CD8+T淋巴細胞轉移到Rag1-/-小鼠體內，結果導致了肝臟特異的自身免疫性膽管炎；而將CD4+T淋巴細胞轉移到Rag1-/-小鼠體內形成了結腸炎，提示CD8+T淋巴細胞是dnTGFβ RⅡ小鼠發生膽管損傷的主要貢獻者[7]。因此，缺陷的TGFβ RⅡ信號傳導和以膽管細胞為靶點的抗原特異性克隆CD8+T淋巴細胞是誘導自身免疫性膽管炎所必需的[8]。

1.2 NOD.c3c4小鼠模型 非肥胖型糖尿病(non obesity diabetic，NOD)小鼠原本用于研究自身免疫性1型糖尿病。NOD.c3c4同源小鼠是在NOD小鼠背景下，將B6/B10來源的胰島素依賴性糖尿病(insulin-dependent diabetes，Idd)抗性等位基因分別插入到NOD小鼠的3、4號染色體(c3.c4)上，以阻止糖尿病的發生。然而，實驗觀察到僅染色體3上具有B6抗性等位基因的NOD小鼠表現出肝內有淋巴細胞浸潤，但無自身抗體形成；僅染色體4上具有B10抗性等位基因的NOD小鼠肝內無淋巴細胞浸潤，但有自身抗體形成[9]。可見，雖然保護性c3/c4基因座的組合可以有效預防糖尿病，但B6和B10抗性等位基因與NOD基因組發生交互作用后，可導致一種新型的遺傳控制的自身免疫性肝病。

NOD.c3c4同源小鼠的表型特征：(1)血清ALT和AST升高；(2)因膽道疾病引起肝腫大，甚至肝衰竭；(3)膽道梗阻癥狀逐漸加重，導致腹水形成；(4)50%～60%的NOD.c3c4小鼠在9～10周時自發產生針對PDC-E2的自身抗體AMA；80%～90%的NOD.c3c4小鼠在20周時出現血清ANA陽性，最顯著的是抗Sm抗體；(5)肝內膽管囊腫進行性形成，伴有囊腫壁周圍淋巴細胞浸潤，以CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞為主；(6)上皮樣肉芽腫形成；(7)胰腺出現輕度炎癥和唾液腺內有淋巴細胞浸潤；(8)自身免疫性膽管炎可以通過免疫細胞如脾細胞或CD4+T淋巴細胞轉移至NOD.c3c4免疫缺陷小鼠[9-10](表1)。

該模型與人類PBC的不同點表現在NOD.c3c4小鼠發病無性別差異，ALP無法測得，Ig以IgA升高為主，AMA的陽性率約為60%，具有比人類PBC更加廣泛的膽管增生改變和自身免疫攻擊部位，NOD.c3c4小鼠以膽總管和肝內膽管為靶標，而PBC主要攻擊肝內中小膽管[11]。

人類PBC的組織學特征為早期膽管周圍肉芽腫形成、門靜脈周圍嗜酸粒細胞浸潤和肝內小膽管破壞，稱為非化膿性破壞性膽管炎。Terasaki等[12]發現PBC早期的嗜酸粒細胞增多與膽管周圍淋巴細胞浸潤、肉芽腫形成和膽管損傷呈正相關。NOD.c3c4小鼠組織學以肝內膽管多囊性病變為特點，與人類PBC相同的變化是二者均為非化膿性破壞性膽管炎，另可見到損傷膽管周圍嗜酸性粒細胞浸潤和上皮樣肉芽腫病變[10]。

1.3 AE2a,b-/-小鼠模型 Cl-/HCO3-陰離子交換器2(Cl-/HCO3-anion exchanger 2，AE2)是一種廣泛表達的膜溶質載體，為電中性的Na+依賴性交換器，具有調節細胞內pH穩態、Cl-濃度和細胞體積等作用[13-14]。在膽管細胞中，碳酸氫鹽分泌由AE2介導。在極化上皮細胞中，AE2有助于上皮細胞分泌和重吸收酸堿等同物和Cl-；細胞內或細胞外H+可緊急獨立抑制AE2，該調節需要AE2 N末端胞質結構域的最高度保守序列的完整性[15-16]。

表1 人類PBC與PBC動物模型的特點比較

AE2a,b-/-小鼠的表型特征：(1)脾臟腫大；(2)血清AMA陽性(82%)；(3)血清IgM和IgG升高；(4)血清ALT、AST和ALP水平均升高；(5)小鼠脾臟T淋巴細胞群中CD8+細胞的比例和絕對數量顯著增加，CD4+細胞未見明顯變化，出現CD4+/CD8+比例倒置；(6)肝組織學觀察到明顯的膽管炎、膽汁淤積表現，損傷的膽管周圍有大量CD4+和CD8+T淋巴細胞浸潤，以CD8+T淋巴細胞為主，出現CD4+/CD8+比例倒置現象，偶見嗜酸性粒細胞；(7)血清IFNγ和IL-12p70水平升高；(8)實時PCR表明，AE2a,b-/-小鼠膽管細胞表現出在參與細胞氧化還原穩態和主要組織相容性復合體I類抗原呈遞過程中的基因表達改變[17](表1)。膽管細胞中AE2的缺乏似乎擾亂了氧化還原平衡和蛋白質穩態，使膽管細胞易于被CD8+T淋巴細胞靶向攻擊。

多項研究[18-20]觀察到PBC患者的肝組織和外周血單核細胞中AE2 mRNA的表達減少，免疫組織化學顯示PBC患者的膽管和肝細胞中AE2蛋白的表達降低；而且，從PBC患者分離培養的膽管細胞顯示AE2存在明顯缺陷。Banales等[21]研究發現來自PBC患者的膽管細胞中miR-506上調，與AE2 mRNA的3′UTR區域結合，防止蛋白質翻譯，導致AE2活性降低，膽汁分泌功能受損。熊去氧膽酸是一種誘導碳酸氫鹽富集的膽汁酸，可改善PBC患者的臨床過程[22]。Prieto 等[23]研究PBC患者的肝活組織檢查標本發現AE2 mRNA水平明顯低于健康對照組，而使用熊去氧膽酸治療后，AE2 mRNA水平升高至正常范圍。AE2a,b-/-小鼠幾乎所有淋巴細胞均具有Na+-HCO3-共轉運體的酸化潛力，而CD8+T淋巴細胞卻缺乏這種酸負荷機制，表現為堿化細胞內pH[24]。Mardones等[25]使用AE2a,b-/-小鼠的成纖維細胞觀察在靜息細胞內pH中堿性位移對cAMP信號和基因表達激活的影響，結果顯示通過AE2的碳酸氫鹽轉運維持了培養的小鼠成纖維細胞內pH平衡，并揭示了cAMP在慢性堿化細胞反應中的作用。可見，AE2缺陷可能是PBC發病的重要機制之一。

1.4 ARE-Del-/-小鼠模型 ARE-Del-/-小鼠模型是通過敲出IFNγ基因3′非翻譯區中具有162nt的腺嘌呤尿嘧啶富含元件(adenylate uridylate-rich element，ARE)而形成[26]。

該模型的生物表型特征包括：(1)20周齡時，雌性ARE-Del-/-小鼠比雄性小鼠的ALT、AST和總膽汁酸水平顯著升高；(2)20周齡雌性ARE-Del-/-小鼠比雄性小鼠的肝臟門靜脈區具有更加嚴重的淋巴細胞浸潤、膽管損傷和肉芽腫形成；天狼猩紅染色顯示雌性ARE-Del-/-小鼠肝內輕度纖維化，而雄性小鼠纖維化不明顯；(3)8～10周齡時，雌性ARE-Del-/-小鼠可檢測到針對PDC-E2，BCOADCE2和OGDC-E2的自身抗體，主要是針對PDC-E2的抗體；(4)20周齡雌性ARE-Del-/-小鼠皮膚色素沉著明顯增加，可能與膽管破壞導致膽汁流不足有關；(5)雌性ARE-Del-/-小鼠對趨化因子(IFNc誘導的單核因子、IFNc誘導型蛋白10和巨噬細胞炎性蛋白1β)和細胞因子(TNFα，IL-10和IL-13)具有更強的誘導作用；(6)從ARE-Del-/-轉移到B6/Rag1-/-小鼠的CD4+T淋巴細胞誘導了中度的門靜脈炎癥和實質炎癥；(7)肝臟基因表達的RNA測序顯示上調基因與PBC膽管上皮細胞的基因表達特異性重疊，雌性小鼠中差異表達的基因具有更強的1型和2型IFN信號傳導和淋巴細胞介導的免疫應答，表明IFNγ可能是推動PBC女性高發的重要因素[27](表1)。

該模型與人類PBC的不同點在于ALP無法測得、門靜脈炎癥和肝實質炎癥主要由CD4+T淋巴細胞誘導，以及肝纖維化程度偏輕等。

2 化學或生物染毒類模型

2.1 2-辛炔酸偶聯牛血清白蛋白(2-octynoic acid coupled to bovine serum albumin，2OA-BSA)小鼠模型

20A-BSA誘導的模型是指在完全弗氏佐劑的存在下，用2OA-BSA(100 μg/25 μl)腹膜內接種免疫小鼠，隨后每個2周進行腹膜內接種加強1次以誘導模型。

2OA-BSA小鼠模型的血清和病理學特征：(1)特異性AMA陽性率100%且抗體水平明顯升高；(2)用2OA-BSA免疫4周時小鼠血清中TNFα和IFNγ顯著增加；(3)門靜脈周圍有大量淋巴細胞浸潤，以CD4+和CD8+T淋巴細胞為主；(4)損傷膽管周圍有輕度淋巴細胞或單核細胞浸潤；(5)匯管區和肝實質中見上皮樣肉芽腫形成；(6)肝實質中見少量肝細胞灶性壞死；(7)2OA-BSA免疫12周后，肝臟中CD4+T淋巴細胞比例降低，CD8+T淋巴細胞比例增高，CD4/CD8比值倒置；脾臟中CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞比例均降低，且CD4/CD8比值下降但無統計學差異[28](表1)。

不同于人類PBC的血清和病理學特征：(1)用2OA-BSA免疫24周時，未能檢測到血清ALP等反映膽汁淤積的相關酶；(2)肝纖維化不明顯；(3)未觀察到肝內脂肪變性、嗜酸性粒細胞增多或膽汁淤積的改變；(4)其他組織如甲狀腺、唾液腺、肺、腎、小腸和結腸等是正常的，未見免疫損傷，而PBC與多種肝外器官中的自身免疫病變相關[28]。

2.2 聚肌苷酸聚胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid，poly Ⅰ：C)小鼠模型 polyⅠ：C是一種1型IFN誘導劑，可誘導產生自身免疫性膽管炎。polyⅠ：C以5 mg/kg腹腔內注射雌性C57BL/6小鼠，2次/周，持續24～28周，即可制成polyⅠ：C小鼠模型。

該動物模型的血清和病理學特征：(1)特異性AMA檢出率80%～100%；(2)血清ALT和ALP水平升高；(3)polyⅠ：C注射后3～6 h血清IFNα水平達到高峰，后逐漸下降，24 h后幾乎檢測不到；(4)誘導IL-12p70、IL-10、IL-6、單核細胞趨化蛋白-1、IFNγ等促炎細胞因子；(5)匯管區有大量炎癥細胞浸潤，T淋巴細胞和B淋巴細胞是構成浸潤細胞的主體；在T淋巴細胞中，CD4+和CD8+T淋巴細胞在肝內均有定位，而CD8+T淋巴細胞的定位更靠近膽管。(6)在注射4周后，小鼠出現唾液腺炎、胰腺炎和間質性腎炎[29](表1)。可見，IFNα單獨或與其他細胞因子結合可能是誘導PBC發病的關鍵因素，該模型可用于分析PBC的早期細胞事件。

Ambrosini等[30]觀察2OA-BSA與polyⅠ：C偶聯免疫小鼠是否會改變疾病過程，結果加入polyⅠ：C后導致自身免疫性膽管炎嚴重惡化，浸潤性CD8+T淋巴細胞顯著增加，促炎細胞因子水平也顯著升高。提示先天免疫在自身免疫性膽管炎自然史中發揮重要作用。

2.3 大腸桿菌免疫小鼠模型 通過靜脈內注射大腸桿菌感染NOD.B6-Idd10/Idd18小鼠，可制作血清AMA陽性和嚴重膽管炎的動物模型，這可能與大腸桿菌肽序列中具有6～8個氨基酸殘基與人類PBC的PDC-E2自身表位相同有關[31]。該模型的生物學特征表現為：(1)血清AMA滴度在大腸桿菌感染NOD.B6-Idd10/Idd18小鼠4周時達到峰值，然后逐漸下降；(2)肝組織學顯示在感染大腸桿菌26周時，出現肝內門靜脈周圍炎癥反應和肉芽腫形成；(3)膽管損傷輕重不一，輕者膽管幾乎完整，有輕度的淋巴細胞聚集，重者膽管上皮細胞幾乎完全消失；(4)膽管炎的形成不需要激活NK T淋巴細胞(表1)[11,32]。

雖然該模型針對PDC-E2的反應活性較其他PBC動物模型弱，但在大腸桿菌感染早期抗PDC-E2的啟動足以破壞免疫耐受性，并產生PBC樣的病理損傷[32]。這一點強調了微生物感染在自身免疫性膽管炎中作為主要或共存次要煽動事件的重要性。

3 小結

PBC是一種器官特異性自身免疫性疾病，其免疫耐受性受到損害，但機制不明[33]。PBC的易感性可能是遺傳和環境因素的結合，而環境觸發是導致PBC發生發展的重要因素[34]。盡管PBC與自身免疫現象密切相關，但對經典的免疫抑制劑治療反應較差。自身免疫鼠模型有助于研究PBC疾病發病機制中的早期事件。

AMA的特異性反映了PBC疾病發生的誘導階段[35]。AMA的自身抗原靶標主要包括PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2。對PDC-E2耐受性的喪失是發生PBC的起始關鍵事件。在PBC中，T淋巴細胞和B淋巴細胞的表位集中在PDC-E2的硫辛酰結合域，PDC-E2硫辛酸通過對硫辛酰二硫鍵的親電攻擊進行化學修飾，觸發了對PDC-E2耐受性的破壞[36]。因此，理想的PBC動物模型應具備以下條件：(1)雌性高發；(2)發病年齡：中年；(3)發病受遺傳因素和環境因素的影響；(4)特異性自身抗體：硫辛酰結構域作為顯性抗原表位，血清AMA陽性；(5)免疫失調：肝臟和血液中出現PDC-限制性CD4+和CD8+T淋巴細胞；調節性T淋巴細胞減少；肝臟NK細胞數目增多；(6)病理改變：選擇性膽小管破壞；膽管周圍T淋巴細胞浸潤；肉芽腫形成；最終導致肝纖維化/肝硬化[37]。

基因修飾類小鼠模型如dnTGFβ RⅡ小鼠、NOD.c3c4小鼠、AE2a,b-/-小鼠和ARE-Del-/-小鼠，這些小鼠模型具有一個共同點就是自發形成PBC的選擇性特征，如產生特異性自身免疫抗體AMA。化學或生物染毒誘導的PBC模型如2OA-BSA小鼠和polyⅠ:C小鼠模型，這些小鼠免疫耐受性的喪失主要是通過化學或生物染毒來誘導的。上述小鼠模型雖在某些方面模擬了PBC的發病特征，但仍存在多方面不足，因缺乏人類PBC診斷的基本標準，這些小鼠模型目前尚未被完全接受。

事實上，PBC是多種因素共同作用導致的，單一的動物模型很難完全模擬其免疫病理生理機制[11]，目前這些動物模型雖有不同的缺陷，但已提高了對PBC病因和主要免疫學途徑的認識。今后隨著更加理想的動物模型問世，必將促進對PBC發病機制的深入理解及其藥物研制。

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引證本文：HAO J, LIU CH. A study on animal models of primary biliary cholangitis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(11): 2117-2122. (in Chinese)

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(本文編輯：邢翔宇)

Astudyonanimalmodelsofprimarybiliarycholangitis

HAOJuan,LIUChenghai.

(InstituteofHepatology,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

An ideal animal model of primary biliary cholangitis (PBC) plays an important role in the research on physiopathological mechanism and drug research and development. In recent years, great achievements have been made in animal models which can reflect the features of PBC, such as positive serum anti-mitochondrial antibody and immunopathological injury of the bile duct. There are various methods for the preparation of animal models of PBC at present, including chemical or biological exposure and gene knockout. However, these models cannot completely simulate PBC in humans, since they have different serological, immunological, and histopathological features. This suggests the complexity of pathological mechanisms of PBC, including gene specificity and environmental changes and helps us to understand the pathogenesis of events in the early stage of PBC, such as the break of immune tolerance and specific attack of biliary epithelial cells.

cholangitis, biliary; models, animal

R575.22

A

1001-5256(2017)11-2117-06

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.11.013

2017-09-01；

2017-09-04。

郝娟(1985-)，女，主要從事中西醫結合防治慢性肝病研究。

劉成海，電子信箱：chenghailiu@hotmail.com。