液質質聯用法測定淡水水體與沉積物中有（無）色孔雀石綠的改進

陳永平+張素青+李春青+高麗娜+時文博

摘 要：對淡水水體和沉積物中孔雀石綠（MG）及無色孔雀石綠（LMG）的高效液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）檢測方法進行改進。主要對水及沉積物中孔雀石綠及無色孔雀石綠提取試劑進行優化探索，結果表明：二氯甲烷作為提取試劑提取效果最佳，兩種待測物線性范圍為0.20～100 ng/mL，r2≥0.999，空白水體在2.0、10、25 ng/L 3個加標水平下的平均回收率為78.3%～88.8%，相對標準偏差（RSD）為1.2%～3.3%，檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.20 ng/L和0.40 ng/L。空白沉積物基質在0.2、2.0、10 μg/kg 3個加標水平下，平均回收率為78.9%～86.7%，RSD為0.6%～3.3%，檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.020 μg/kg和0.040 μg/kg。該方法靈敏度高、選擇性好，適用于淡水養殖環境水體和沉積物中MG和LMG的殘留測定。

關鍵詞：LC-MS/MS；淡水水體；沉積物；有色孔雀石綠；無色孔雀石綠

孔雀石綠（MG）是一種合成的工業染料[1]。由于其還具有有效殺滅真菌、寄生蟲等病原微生物的作用，在水產養殖中曾被用來預防和治療受精卵和成魚的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等，以及用于活魚運輸、暫養和環境的消毒等[2]。然而，孔雀石綠在生物體內有大量蓄積時，表現出高毒、代謝周期長、“三致”等毒副作用，還對生物體的組織、生殖、免疫系統產生影響，尤其是其代謝產物無色孔雀石綠（LMG）毒性更大[3]。雖然孔雀石綠在水產養殖中的違禁使用情況越來越少，但由于其曾經被廣泛應用，已對環境造成了嚴重的次生污染，經調查發現，MG和LMG主要存在于水體及表層沉積物中。目前，針對水體、沉積物環境中的痕量MG和LMG檢測方法相對還不成熟，當前主要采用靈敏度較低的液相色譜法、超高效液相質譜聯用法[4-6]。由于沉積物中富集多種有機質，分析易產生干擾，導致高效液相色譜法定性不準確。而高效液相色譜串聯質譜法由于靈敏度高、選擇性強，因此針對MG和LMG藥物殘留檢測具有較強的優勢。目前報道了采用高效液相色譜串聯質譜法測定水或沉積物中MG和LMG殘留[6]，但其前處理方法較繁瑣，回收率低，不適合大批量樣品、痕量分析的需要。本研究充分利用高效液相色譜串聯質譜靈敏度高、選擇性強的優點，選擇乙腈、乙酸乙酯、按一定比例混合的乙腈和二氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷等多種試劑提取化合物，通過加標回收率實驗對比，篩選出二氯甲烷作為水體及沉積物中的孔雀石綠及其代謝物的提取試劑效果最佳，改進后的方法高效、靈敏、定性定量準確，可為孔雀石綠污染來源排查及評價養殖環境提供可靠的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器設備

液質質聯用儀（美國AB公司），天平（賽多利斯公司）；高速離心機（美國Sigma公司）；高速組織勻漿機（飛利浦公司 轉速10 000 r/min），MS1 Mini-shaker 渦輪振蕩器（IKA 公司）；MiLLi-Q純水器（MiLLipore 公司）；氮吹儀（Organomation Associates 公司）；旋轉蒸發儀（BUCHI 公司）；移液器（艾本德 公司）。

1.2 試劑與材料

有色孔雀石綠（MG）、無色孔雀石綠（LMG）、有色孔雀石綠-D5、無色孔雀石綠-D6標準品，純度均≥98%（德國Dr 公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；二氯甲烷（色譜純，美國FLuka 公司）；實驗用水由MiLLipore純水系統（美國MiLLipore公司）制備；乙酸銨（LC/MS 級）、乙酸（色譜純）、甲酸（純度>98%）均購自美國FLuka公司；N，N，N'，N'-四甲基對苯二胺（TMPD，生物試劑），濃鹽酸（分析純）；乙酸銨（色譜純）；中性氧化鋁柱。

1.3 溶液

1.3.1 2 mmoL/L乙酸銨緩沖溶液 稱取0.030 g無水乙酸銨溶解于適量水中，定容至500 mL，再加入0.5 mL甲酸。

1.3.2 TMPD溶液（1.0 g/L） 稱取50 mg TMPD 溶于50 mL甲醇中。

1.3.3 有色孔雀石綠草酸鹽（MG）、無色孔雀石綠（LMG）及其內標標準儲備液（100 μg/mL） 準確稱取適量的有色孔雀石綠、無色孔雀石綠及其內標標準品，分別用乙腈溶解并定容，-18 ℃避光保存，有效期1年。

1.3.4 混合標準及內標中間液（1.0 μg/mL） 分別準確吸取1.00 mL有色孔雀石綠、無色孔雀石綠及其內標標準儲備液于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，-18 ℃避光保存，有效期3個月。

1.3.5 混合標準使用液（0.10 μg/mL） 準確吸取1.0 mL混合標準中間液于10.0 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，-18 ℃避光保存，有效期1個月。

1.3.6 混合內標標準使用液（0.10 μg/mL） 準確吸取1.0 mL混合內標標準中間液于10.0 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，-18 ℃避光保存，有效期1個月。

1.3.7 混合標準工作液 臨用時準確吸取一定量的混合標準使用液，加入混合內標標準使用液20 μL，用乙腈和5 mmoL/L乙酸銨緩沖溶液（1：1，V/V）稀釋定容至1 mL，標準曲線系列濃度分別為0.50、1.0、2.0、5.0、10、20 ng/mL。

1.4 沉積物的制備

將剛采的濕沉積物置于陰涼通風處風干，風干后再進行敲碎、研磨直至成粉狀，密封于廣口瓶中，4 ℃冰箱保存，待測。

1.5 色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS （75×2.1 mm， 2.2 μm）；色譜柱溫度：30 ℃；樣品盤溫度：15 ℃；流動相A相：2 mmoL/L的乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）；流動相B項：乙腈（0.1%甲酸）；進樣體積：5 μL；流速：0.25 mL/min，具體參數見表1。endprint

1.6 質譜條件

離子化模式：ESI源，正離子掃描；離子源溫度：600 ℃；氣簾氣：20 psi；碰撞氣（CAD）：中；離子化電壓：5 000 v；霧化氣：60 psi；輔助氣：40 psi。

掃描模式：選擇性離子掃描（MRM），母離子、子離子荷質比、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

1.7 前處理方法

水樣：取1 000 mL水，分液漏斗中，加入40 μL內標混合液（0.1 μg/mL），加入300 μL三甲基戊二醇（TMPD）溶液，加入30 mL的二氯甲烷，振搖5 min，靜置30 min，取下層二氯甲烷于雞心瓶中，再加入30 mL二氯甲烷重復一次，將下層液合并于雞心瓶中，旋轉蒸發濃縮近干，殘留物加入2.0 mL的乙腈-2 mmoL/L乙酸銨溶液（1∶1），渦旋振蕩1 min，超聲波振蕩2 min，過0.22 μm白色微濾膜于進樣瓶中，上機測定。

粉末沉積物：準確稱取（5.0±0.01） g粉末狀沉積物樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入40 μL內標溶液（100 ng/mL），加入200 μL TMPD溶液，加入10 mL二氯甲烷，渦旋震蕩2 min，超聲萃取5 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液于20 mL玻璃離心管中，再向離心管中加入10 mL二氯甲烷，重復上述操作，合并上清液于20 mL玻璃離心管中，氮氣吹至近干，殘留物加入2.0 mL的乙腈-2 mmoL/L乙酸銨溶液（1∶1），渦旋振蕩1 min，超聲波振蕩2 min，過SHIMADZU-GL Ⅱ MCE 0.22 μm有機相濾膜后，上機測定。

2 結果與討論

2.1 液相色譜及質譜條件的優化

在已有文獻的研究基礎上，無機相選擇2.0 mmoL乙酸銨0.1%甲酸，分別選擇乙腈、甲醇、乙腈（0.1%甲酸）、甲醇（0.1%甲酸）有機相，實驗結果表明有機相為乙腈（0.1%甲酸）洗脫出峰效果最佳，這可能與梯度洗脫時甲酸濃度保持一致，離子化效果較好所致。

根據MG 和LMG 的化學性質，選擇ESI 正離子模式。以濃度為50 ng/mL有（無）色孔雀石綠與氘代有（無）色孔雀石綠作為優化標液。首先通過Q1全掃描確定化合物母離子質荷比，再通過Q3子離子掃描確定定量和定性離子的質荷比，根據確定的母離子和子離子優化去簇電壓和碰撞能量，最后優化離子源溫度、電壓等參數。

2.2 水及沉積物中孔雀石綠提取劑的優化

根據相關文獻報道沉積物中提取目標化合物需加入一定量的TMPD作為抗氧化劑來提高樣品中MG 和LMG 的回收率[6]。本實驗沉積物中孔雀石綠的提取選擇乙腈：二氯甲烷（15∶10）混合液、純乙腈、二氯甲烷分別作為沉積物、水基質中孔雀石綠提取試劑，實驗結果表明：乙腈∶二氯甲烷（15∶10）混合液提取時，離心后不分層，將全部提取液濃縮至干，定容，測定結果回收率低于70%，實驗耗時長；純乙腈提取，濃縮較耗時，回收率低于70%，穩定性差；二氯甲烷作為提取劑，再加入20 mL TMPD解吸附溶液，回收率80%以上，穩定性好，最終二氯甲烷作為沉積物、水中孔雀石綠提取試劑。

本實驗水體中目標化合物的提取同理加入一定量的TMPD作為抗氧化劑來提高樣品中MG 和LMG 的回收率，提取方式選擇固相萃取柱富集和有機相（二氯甲烷、乙酸乙酯）富集兩種方式對比實驗，實驗結果表明固相萃取柱富集要求水體較純凈，實驗過程過柱速度較慢實驗耗時較長，平均回收率60%～70%，有機相提取方式相對要求水體純凈程度較低，富集時間較短，兩種試劑提取效果表明二氯甲烷明顯優于乙酸乙酯，平均回收率大于70%，最終實驗選擇有機相提取方式，二氯甲烷作為提取水體中的目標化合物的提取試劑。

2.3 方法的標準曲線與準確度

內標法定量，MG和LMG兩者質量濃度均在0.2～100 ng/mL 范圍內與峰面積呈良好的線性關系，線性方程：MG y=0.334 x+0.015 8（r2=1.000），LMG y=0.618 x+0.007 83（r2=1.000），r2均大于0.999。回收率均大于80%，大大減少了基質效應或其他實驗條件帶來的偏差，采用向陰性樣品中添加標準物質的方法，進一步考察方法的靈敏度。在方法規定的取樣體積和定容體積下，按3倍信噪比計算得該方法在環境水樣和底泥樣品中的檢出限（LOD）分別為0.2 ng/L和0.02 μg/kg，以信噪比S/N>10得其定量下限（LOQ）分別為0.4 ng/L和0.04 μg/kg。標準圖見圖1。

2.4 方法的回收率與精密度

采用空白加標的方式，在環境水樣中分別添加2.0、10、25 ng/L，沉積物中MG 和LMG 分別添加0.20、2.0、10 μg/kg 3個濃度梯度，按照本方法處理后測定，回收率和相對標準偏差見表3。沉積物中有色孔雀石綠的平均回收率為82.9%～84.4%，RSD為1.4%～3.5%；沉積物無色孔雀石綠的平均回收率為78.9%～86.7%，RSD為0.8%～5.2%，沉積物中空白及加標圖分別見圖2、圖3。水體中有色孔雀石綠的平均回收率為78.3%～86%，RSD為1.2%～2.6%；水體中無色孔雀石綠的平均回收率為81.5%～88.8%，RSD 為0.6%～3.3%。因此，MG和LMG在水產養殖環境水和沉積物中的加標回收率均能達到檢測要求，說明本方法具有較高的準確性。同時，RSD均低于15%，表明結果在置信區間內，本方法具有較高的可靠性。

2.5 實際樣品的測定

采用該方法測定天津津南區、西青區6家水產養殖場的養殖池塘水體和沉積物中有（無）色孔雀石綠的殘留情況，結果表明：一家企業有無色孔雀石綠檢出，水中無色孔雀石綠濃度為2.1～4.3 ng/L，沉積物中無色孔雀石綠的濃度為0.6～3.5 μg/kg，其他企業均未檢出。經進一步調查，發現該養殖企業在幾年前確曾采用過MG來防治和治療水霉病，因此，該方法可用于水產養殖環境水體和底泥中MG 和LMG殘留量的測定。

3 結論

本文通過優化液液萃取條件，改進了水產養殖環境水體和沉積物中有（無）色孔雀石綠殘留的高靈敏分析和確證方法。結果表明，本方法在0.2～100 ng/mL 范圍內呈現良好的線性關系，水體和沉積物中的檢出限分別為0.2 ng/L 和0.02 μg/kg；相對標準偏差（RSD） 均小于15%。該方法步驟簡單、回收率高、精密度良好，可作為水體和沉積物中MG及其代謝物LMG殘留的檢測方法，并可為MG及LMG在水產品中的富集規律與養殖環境中MG及其代謝物LMG殘留的相關性分析及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段，為水產品中MG及LMG溯源和質量監督提供檢測技術支持。

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