Cortactin及CyclinD1在食管鱗狀細胞癌組織中的差異表達及臨床病理相關性分析

胡艷萍,吳林林,楊建杰

(首都醫科大學附屬北京潞河醫院 病理科,北京101149)

Cortactin及CyclinD1在食管鱗狀細胞癌組織中的差異表達及臨床病理相關性分析

胡艷萍*,吳林林,楊建杰

(首都醫科大學附屬北京潞河醫院 病理科,北京101149)

目的探討Cortactin及CyclinD1在食管鱗狀細胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma ESCC)組織中差異表達，并結合臨床因素進行臨床病理相關分析。方法運用免疫組織化學(Immunohistochemistry IHC)方法檢測Cortactin及CyclinD1在116例ESCC組織中的差異表達情況，并分析Cortactin及CyclinD1與ESCC各項臨床因素的相關性。結果Cortactin及CyclinD1的高表達率在正常食管粘膜標本(Normal Squamous Cell，NS)組(41.9%，0%)與ESCC組(58.6%，43.9%)間相比明顯升高，具有明顯統計學差異(Plt;0.05)，且在不同分化ESCC組間亦存在明顯統計學差異(Plt;0.05)；Kaplan-Meier生存分析顯示：隨著Cortactin及CyclinD1的高表達的升高,ESCC患者死亡率亦呈升高趨勢，且CyclinD1的高表達與ESCC患者的生存率具有相關性(P=0.01)。結論Cortactin及CyclinD1在ESCC組中上調表達，可為ESCC指導預后及臨床管理提供輔助參考；生存分析結果對于指導ESCC患者的術后管理，從病因學角度防控ESCC的發生發展以及早期食管癌的進展、減少晚期ESCC的發生可能具有重要分子病理學價值。

食管；免疫組化；鱗狀細胞癌；Cortactin；CyclinD1；病理學

(ChinJLabDiagn,2017,21:1915)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，發生率位于全球惡性腫瘤的第七位，病死率居第六位[1]。 盡管消化內鏡檢查提高了部分早期食管癌病變的發現，然而大部分病例直到疾病的晚期癥狀都不明顯，確診已是ESCC中晚期，預后差，病死率高。ESCC治療現狀尚不十分樂觀，術前新輔助放化療不能明顯降低術后局部復發率，5年生存率仍徘徊在5%和20%之間[2]。Cortactin基因存在于與基底膜連接處的上皮細胞漿內，主要調節黏附與連接成分之間的相互作用。Cortactin可參與組成癌細胞骨架和黏附結構，在調節膜動力學、肌動蛋白網絡構成、細胞黏附和侵襲以及基質降解等方面發揮作用[3]。CyclinD1在多種惡性腫瘤(頭頸部SCC、乳腺癌、食管癌和肝細胞癌)中存在過度表達，對于指導腫瘤的臨床治療和預后判斷具有重要臨床意義[4]。

本研究通過IHC檢測Cortactin及CyclinD1 蛋白標記物在不同分化級別的ESCC組織中的差異表達情況，分析Cortactin及CyclinD1對于深入理解ESCC的分子生物學變化機制及特性的潛在應用價值，并且結合ESCC的各項臨床指標進行臨床病理綜合分析，以期探討Cortactin或CyclinD1可能對于輔助ESCC的早期病理診斷、合理的臨床預后評估及指導臨床實施恰當有效的治療都具有非常重要的作用，從而期望能夠在根本上降低ESCC的發病率和死亡率。

1 材料與方法

1.1材料

收集2005-2015年間就診于首都醫科大學附屬北京潞河醫院的ESCC病例116例進行Cortactin及CyclinD1的IHC檢測，所有病例診斷標準參考WHO頭頸部腫瘤病理學和遺傳學(2005)分類系統[5]，被劃分為高分化(High Differentiation HD)、中分化(Moderate Differentiation MD)、低分化(Low Differentiation LD)三個分化級別組，如果病理診斷涵蓋2種分化級別，如“HD-MD”，將以較高分化級別作為病理診斷結果[6]。入組病例條件包括：(1)無既往ESCC病史的初診病例；(2)所收集ESCC病例包括內窺鏡活檢和/或根治標本，病理切片行蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin HE)染色；(3)所有病例經3位病理醫師聯合會診，病理分級診斷意見一致；(4)所有病例具有完整的臨床及隨訪資料；(5)最短隨訪時間為2.5年，或截止于患者去世。另外，按照2005年WHO病理診斷標準,選取3位病理醫師診斷意見一致的，被覆正常鱗狀上皮的食管粘膜標本(Normal Squamous Cell，NS)112例設為陰性對照組。

1.2主要試劑及方法

1.2.1主要試劑

所有組織均經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，切片厚度為4 μm，免疫組化膠片貼附。Cortactin兔抗人多克隆抗體購自GeneTex公司，CyclinD1鼠抗人單克隆抗體及IHC染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。所有116例ESCC標本及112例陰性對照組標本均進行Cortactin及CyclinD1的IHC染色，EnVision二步法IHC染色參照試劑盒使用說明書進行。

1.2.2IHC染色結果判定

抗體陽性的判定標準為在背景清晰的情況下，特定部位呈均勻的棕黃色顆粒狀著色，Cortactin定位于細胞漿/膜，CyclinD1定位于細胞核。在10×40 倍光鏡下隨機選取10 個視野進行觀察，每個視野計數100 個細胞，共計1000個細胞，結合染色強度和范圍進行結果判定。所有IHC結果判定由2位病理醫師共同閱片完成，為了便于統計學分析Cortactin及CyclinD1的表達與臨床因素的相關性，所有病例的IHC染色結果評分如下：0-10% —0；11-25%—1+；26-50%—2+；51-75%—3+；gt;51%強陽性或gt;75%—4+。而后按照評分設為兩組，即低表達組(0+1+2)和高表達組(3+4)。

1.2.3統計學方法

所有數據采用SPSS17.0統計軟件分析。Cortactin及CyclinD1在ESCC各分化組與NS組間的差異表達，以及Cortactin及CyclinD1表達與ESCC臨床因素的相關分析采用χ2檢驗分析； Cortactin及CyclinD1的差異表達與ESCC患者生存率采用Kaplan-Meier生存分析。Plt;0.05表示存在統計學差異。

2 結果

2.1ESCC患者的臨床病理特征

116例ESCC患者年齡范圍43-88歲，中位年齡62.5歲，其中男性100例(86.2%)，女性16例(13.8%)；90.52%的患者主訴為哽噎癥狀(105/116)，哽噎時間0.3-15個月，平均3.3個月；截止目前隨訪結果顯示29例ESCC患者死亡。(表1)

表1 116例ESCC患者的臨床病理特征分布

吸煙指數：吸煙年數×平均吸煙包數

2.2Cortactin及CyclinD1在ESCC組織中的表達情況

以112例NS組織作為陰性對照，Cortactin在116例ESCC組織的表達率明顯升高(圖1)，Cortactin的高表達率由42.0%升高到58.6%(68/116)，具有明顯統計學差異(P=0.01)；另外，Cortactin的高表達率在HD組(37.2%)、MD組(73.6%)及LD組(65.0%)三組間具有明顯統計學差異(P=0.00)，三組內兩兩比較時，HD組分別與MD組(P=0.00)及LD組(P=0.04)均具有統計學差異，且盡管Cortactin的高表達率從MD組(73.6%)到LD組(65.0%)，呈現小幅度逆降趨勢，但未顯示出統計學差異(P=0.05)。

CyclinD1的高表達率從NS組到ESCC組表達率明顯升高(圖2)，自NS組的0%升高至ESCC組的44.0%(51/116)，具有顯著差異(P=0.00)，不僅如此，CyclinD1的高表達率在HD組(30.2%)、MD組(47.2%)及LD組(65.0%)三組間亦呈現逐漸升高的趨勢，并具有統計學差異(P=0.03)，三組內兩兩比較時，僅在HD組與LD組間顯示出明顯統計學差異(P=0.01)，其余各組間均未顯示出統計學差異(Pgt;0.05)。

Cortactin及CyclinD1在ESCC組織及NS對照組織中的差異表達結果見表2。

圖1(A) Cortactin在NS組織細胞中陰性表達 圖1(B) Cortactin在ESCC組織細胞中呈彌漫強胞漿陽性表達

圖1Cortactin在NS及ESCC組織中的差異表達(EnVision法中倍放大)

圖2(A)CyclinD1在NS組織的基底層細胞中陽性表達 圖2(B)CyclinD1在ESCC組織中呈胞核陽性表達

圖2 CyclinD1在NS及ESCC組織中的差異表達( EnVision法 中倍放大) 表2 Cortactin及CyclinD1在ESCC組織及NS對照組織中表達情況

*Plt;0.05： NS vs.ESCC，HD vs.MD vs.LD，HD vs.LD(Cortactin/CyclinD1)；HD vs.MD(Cortactin)

2.3Cortactin及CyclinD1與ESCC臨床病理因素分析及生存分析

116例ESCC病例的臨床病理因素，包括：吸煙、飲酒、脈管內癌栓、神經侵犯等各項指標與Cortactin及CyclinD1的相關性分析結果顯示：Cortactin及CyclinD1的表達與ESCC病例的各項臨床病理因素未顯示出相關性。Cortactin及CyclinD1與ESCC的生存分析顯示：隨著Cortactin的高表達，ESCC病例的死亡率逐漸升高，由18.8%升為29.4%，但未顯示出明顯統計學差異(P=0.19)；隨著CyclinD1的高表達，ESCC病例的死亡率逐漸升高，由15.4%升為37.3%，具有明顯統計學差異(P=0.01)。Cortactin及CyclinD1與ESCC病例臨床病理因素分析結果(表3)。

表3 Cortactin及CyclinD1與ESCC臨床病理因素分析

*Plt;0.05

3 討論

ESCC的形成是一個多因素相互作用、多階段發展、多基因變異的復雜過程，病因尚不十分清楚，一般認為與致癌因素(煙草和酒精等等)的存在、食管損傷或食物刺激作用(如熱飲料等)、營養不良和微量元素缺乏以及人乳頭狀瘤病毒感染等多方面因素有關。食管癌組織學類型主要包括ESCC和腺癌，兩種類型的分布具有一定的地域性，歐美發達國家約70%為Barrett食管相關的腺癌，以男性白色人種為主，我國則主要以鱗狀細胞癌為主，約占95%[7]。中國是食管癌高發區，每年全球50%的食管癌發生在中國，因食管癌死亡的人數約占我國全部惡性腫瘤死亡總數1/4。近年來對食管癌的病因進行了廣泛的研究，但其發病機制尚不完全明確，而且，大多數食管癌發現已是進展期，預后較差，食管黏膜內癌淋巴結轉移率為1-5%，黏膜下癌淋巴結轉移率則上升到30-50%[8,9]。因此對于ESCC的早期診斷和治療是提高患者生存率的有效途徑之一，尋找有價值的、可進行ESCC早期預警或提示靶向治療的分子標志物成為ESCC研究中亟待解決的問題[10]，特異性識別的分子標志物的認識和發現可有助于深入理解ESCC的分子生物學變化機制及特性，進而可能對ESCC進行明確的病理診斷、合理的預后評估及指導臨床實施有效的靶向治療都具有非常重要的作用。

Cortactin基因在乳腺癌、頭頸部SCC中都存在異常表達，對于促進腫瘤細胞的侵襲和轉移具有重要作用[3,11]，提示Cortactin基因可作為有價值的潛在分子標志物，用于輔助判斷頭頸部SCC復發和轉移以及評估癌前病變的預后等。Cyclin D1與CDKs (Cyclin-dependent Kinases，周期素依賴性激酶)和CKIs (Cyclin-dependent Kinases Inhibitors，周期素依賴性激酶抑制因子)一起對細胞周期起調控作用。Cyclin D1含295個氨基酸，由11q13染色體的CCND1基因編碼，是細胞周期中短暫出現的基因表達產物，具有嚴格的周期順序性，可在G1/S 交界處將信號轉導途徑與細胞周期調控聯系起來，完成細胞分裂和增殖過程中各個時期的轉換而后降解，對于腫瘤細胞的增殖和分化具有重要作用[12]。Gibcus[13]等研究顯示喉癌的核心擴增區域是在11q13中一段約1.7Mb的序列，包含13種擴增基因，其中包括 CCND1、Cortactin、FLJ42258、ORAOV1、FGF19、FADD、PPFIA1等，較為重要的是Cortactin 及Cyclin D1，對于11q13序列的擴增起關鍵性作用。11q13染色體區域序列在多種惡性腫瘤組織中存在擴增表達，包括頭頸部SCC、乳腺癌、食道癌、肺癌、卵巢癌以及膀胱癌等，且Cortactin的擴增表達與頭頸部SCC患者的進展及預后不良相關[14,15]。

與正常鱗狀上皮組織相比，Cortactin及CyclinD1在116例ESCC組織的表達率明顯升高，均具有明顯統計學差異(Plt;0.05)，且在HD、MD及LD三組不同分化組間具有明顯統計學差異(Plt;0.05)。Cortactin及CyclinD1在ESCC組織中的上調表達趨勢，提示Cortactin與CyclinD1的表達調控在ESCC的發生、發展機制中可能起到了一定的促進作用，因此，對于ESCC早期發現并提早進行臨床干預管理，進而提高患者的生存率，減少死亡率具有重要意義。Cortactin及CyclinD1與ESCC的生存分析顯示，隨著Cortactin及CyclinD1的高表達，ESCC病例的死亡率均逐漸升高，且CyclinD1的高表達與ESCC的生存率之間存在著明顯統計學差異，研究結果對于指導臨床進行ESCC病例的術后管理、減少晚期ESCC的發生率可能具有一定的意義，進而幫助臨床醫師從病因學角度防控ESCC的發生發展以及早期食管癌的進展可能提供了重要的線索。另外，Cortactin及CyclinD1兩種蛋白均位于microRNA-34c-5p的靶基因通路中，為其下游調控基因，本研究結果為進一步探尋microRNA在ESCC組織中的差異變化情況提供了線索，盡管相應的具體作用機制和調控途徑仍不明確，有待于進一步擴大樣本的深入研究以及更多臨床資料和分子生物學實驗加以證實。

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TheDys-expressionofCortactinandCyclinD1inEsophagealSquamousCellCarcinomaandclinicopathologicalcorrelationanalysis

HUYan-ping,WULin-lin,YANGJian-jie.

(DepartmentofPathology,BeijingLuHeHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China)

ObjectiveTo investigate the dys-expression of Cortactin and CyclinD1 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma(ESCC) and to analyze the correlations between its dys-regulation with clinicopathological parameters of ESCC.MethodsThe expression of Cortactin and CyclinD1 in 116 cases of ESCC was detected by Immunohistochemistry,and the clinicopathological correlations was analyzed with the clinical and follow-up data of all ESCC.ResultsThe high-expression of Cortactin and CyclinD1 was detected in ESCC group(58.6%，43.9%) combined with NS group(41.9%，0%),which showed significant statistical difference(Plt;0.05),however there also showed significant statistical difference among three differentiated group of ESCC(Plt;0.05);The Kaplan-Meier analysis showed that with the up-regulation expression of Cortactin and CyclinD1,the death rate of ESCC was aslo increased,and the over-expression of CyclinD1 was correlated with the survival rate of patients(P=0.01).ConclusionUp-regulation of Cortactin and CyclinD1 may provide important role for guiding clinical management of ESCC and show potential valuable molecular pathological biomarker for prevention and control of early ESCC progress and reduction of advanced ESCC.

Esophagus;Immunohistochemistry;Squamous Cell Carcinoma;Cortactin;CyclinD1；Pathology

北京市通州區科技計劃項目基金(KJ2016CX037) 北京市通州區衛計委項目基金(TWKY-2016-PT-01-13)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1915-05

R735.1

A

2017-07-13)