Th17/Treg細胞在各型慢性牙周炎中含量的比較分析

張 黎， 張天夫，萬 惠，司 熙*

(1.海南醫學院口腔醫學院,海南 海口5711012;2.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

Th17/Treg細胞在各型慢性牙周炎中含量的比較分析

張 黎1， 張天夫2，萬 惠1，司 熙1*

(1.海南醫學院口腔醫學院,海南 海口5711012;2.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)為最常見的一型牙周炎，約占牙周炎患者的95%。慢性牙周炎CP 可發生于任何年齡，但大多患者為成年人，35 歲后患病率明顯升高，慢性牙周炎是一種多因素疾病，宿主的免疫調節在慢性牙周炎的發生發展過程中發揮了重要作用，機體免疫系統在防御病原微生物的同時會對牙周組織產生病理破壞作用。曾有學者用 Th1/Th2 理論來解釋從牙齦炎到牙周炎的發展過程[1，2]，但近些年來的研究表明，Th1/Th2 模型對牙周炎發病機制的闡述具有明顯的局限性，許多由 T 細胞介導的免疫反應并不能完全用Th1/Th2 模型來解釋[3]，而輔助性 T 細胞 17(T helper cell 17,Th17)和調節性 T 細胞(regulation T cells,Treg)細胞的發現有助于解釋一些經典的 Th1/Th2 模型存在的缺陷。Th17/Treg 的失衡在牙周炎的發病機制中起重要作用[4，5]Th17 和 Treg 在炎癥和自身免疫病中的作用相互拮抗，這一觀點已經被大多數學者接受。Th17 可以促進炎癥和自身免疫，而 Treg 對炎癥和自身免疫則有抑制作用，在自身耐受和免疫調節中起重要作用。Th17 細胞是近期發現的一類 CD4+T 細胞亞群，因其可產生白細胞介素(interleukin，IL-17)而被命名，在宿主抵御胞外菌和真菌感染時發揮作用。目前已經證明，Th17 細胞和其分泌的 IL-17在許多炎癥性疾病和自身免疫病中起重要作用。Treg 細胞屬于 CD4+T 細胞亞群，又被稱為“抑制細胞” ，在自身免疫、抗感染免疫以及抗腫瘤免疫中發揮調節作用。Treg 細胞的功能包括抑制自身免疫、調節免疫應答以防止炎癥損傷。Treg 細胞與Th17細胞一樣，均由 TGF-β 誘導產生。流式細胞術(flow cytometry,FCM)能精確有效的檢測出淋巴細胞亞群中Treg 細胞與Th17細胞表達的情況。

1 材料與方法

1.1主要試劑

Th17/Treg流式分析用試劑 CD4-BB515、IL-17A-PE、IL-17A-PE同型、CD4-FITC、CD25-APC、CD25-APC同型、CD127-PE、CD127-PE同型、紅細胞裂解液、Stain Buffer(FBS)、固定破膜液、刺激劑+蛋白轉運、抑制劑，美國BD公司。

1.2主要設備

流式細胞儀,美國BD公司;臺式離心機,美國Thermo公司;恒溫細胞培養箱,德國Heraeus公司;肝素納抗凝真空采血管,美國BD公司。

1.3病例選擇

選擇2015.1—2015.6來我院就診的 45例慢性牙周炎患者，男性22例，女性23例，年齡22-67 歲，平 均 (30.25±6.51 )歲，均 符合 以 下 標準[1]:(1)全身健康無系統病史；(2)近1年內無牙周治療史；(3)近3個月無服藥史；(4)至少余留20顆牙；(5)中、重度的牙周炎，多個位點探診深度 (PD)≥5 mm，X線片顯示骨喪失。院外均未使用抗生素、激素及免疫類藥物，半個月內未行牙周治療，不伴有系統的嚴重疾病及妊娠、哺乳期婦女，術前心電圖、心肺功能及肝腎功能檢查均正常，排除有高血壓、惡性腫瘤及免疫系統疾病病史者。正常對照組18 例，男性 10 例，女性8例，年齡 20-69歲，平均(32.13±7.19)歲，均為正常體檢者，兩組一般資料比較，差異均無統計學意義(P均gt;0.05)，具有可比性。所有受試者均簽署知情同意書。

1.4實驗分組按照慢性牙周炎的病變程度分為四組：重度牙周炎組、中度牙周炎、輕度牙周炎組、牙周健康組(正常對照組)。前3組每組15例，對照組18例，分別抽取外周血。

1.4.1正常對照組的診斷標準：探診無出血，全口牙的 探診深度≤3 mm，無附著喪失，無牙槽骨吸收，無牙齦退縮。

1.4.2慢性牙周炎輕度組的診斷標準:牙齦有炎癥和探診出血，牙周袋≤4 mm，附著喪失1-2 mm，X線片顯示牙槽骨吸收不超過根長的1/3,可有或無口臭。

1.4.3慢性牙周炎中度組的診斷標準:牙齦有炎癥和探診出血，也可有膿，牙周袋≤6 mm，附著喪失3-4 mm，X線片顯示牙槽骨吸收或角型吸收超過根長的1/3,但不超過根長的1/2,牙可能有輕度松動，多根牙的根分叉區可能有輕度病變。

1.4.4慢性牙周炎重度組的診斷標準:牙齦炎癥較明顯或可發生牙周膿腫，牙周袋gt;6 mm，附著喪失gt;5 mm，X線片顯示牙槽骨吸收超過根長的1/2,多根牙有根分叉病變，牙多有松動[6]。

1.5方法

1.5.2流式細胞術分選Treg 細胞 ①肝素鈉真空抗凝采血管取人外周血全血1-2 ml，血液室溫放置，8 h內進行檢測，否則需棄用。②取7個流式管，分別標記空白管、CD4 抗體單染管、CD25 抗體單染管、CD25 同型對照抗體管、CD127 抗體單染管、CD127 同型對照抗體管、待測管，每個流式管分別加入100 μl 全血。③細胞表面標記染色：向CD4 抗體單染管、CD25 同型對照抗體管、CD127 同型對照抗體管、待測管分別加入1 Test 體積的CD4 抗體。向CD25 抗體單染管、CD127同型對照抗體管、待測管分別加入1 Test 體積的CD25 抗體。向CD25 同型對照抗體管加入1 Test 體積的CD25的同型對照抗體。向CD127 同型對照抗體管加入1 Test 體積的CD127 的同型對照抗體。向CD127 抗體單染管、待測管分別加入1 Test 體積的CD127 的抗體。加入抗體以后渦旋細胞3 s，并室溫避光孵育30 min。④制備紅細胞裂解液：制備1X.紅細胞裂解液(BD Lysing Buffer 10X，貨號555899)，取10X 紅細胞裂解液，按照體積1(10X 紅細胞裂解液)：9(dH2O)，稀釋。⑤每100 μl 全血加入2 ml 1X 紅細胞裂解液，室溫裂解15-30 min，至細胞懸液呈澄清透明狀。⑥裂紅后，500 g，離心5 min，洗滌細胞，離心后棄上清。⑦加入1 ml FBS(貨號554656)，500 g，離心5 min，洗滌細胞，離心后棄上清。⑧加入350 μl FBS(貨號554656)重懸細胞，上流式儀器進行分選。

1.6統計學處理

本實驗所有數據用SPSS21.0軟件處理，數據均以M±SD表示。組內比較采用配對t檢驗；各組兩兩比較為q檢驗,檢驗水準為α=0.05，Plt;0.05為差異有顯著性。

2 結果

重度慢性牙周炎的Treg細胞/CD4細胞比值為5.6%明顯高于健康對照組的4.7%，差異有統計學意義(Plt;0.05)。

中度慢性牙周炎Treg細胞/CD4細胞比值為4.2%略低于健康對照組的4.7%，差異無統計學意義(Pgt;0.05)。

輕度慢性牙周炎 Treg細胞/CD4細胞比值為4.6%接近健康對照組的4.7%，差異無統計學意義(Pgt;0.05)。

各組間比較：輕中慢性牙周炎差異不大，無統計學意義(Pgt;0.05)；輕中慢性牙周炎與重度慢性牙周炎差異明顯，有統計學意義(Plt;0.05)。

重度慢性牙周炎的Th17細胞/CD4細胞比值為2.5%明顯高于健康對照組的1%，差異有統計學意義(Plt;0.05)；中度慢性牙周炎Th17細胞/CD4細胞比值為1.3%略高于健康對照組的1%，差異無統計學意義(Pgt;0.05)；輕度慢性牙周炎Th17細胞/CD4細胞比值為1.4%略高于健康對照組的1%，差異無統計學意義(Pgt;0.05)。輕中度慢性牙周炎之間比較差異不大，無統計學意義(Pgt;0.05)；輕中度慢性牙周炎與重度慢性牙周炎比較差異明顯，有統計學意義(Plt;0.05)。

各組血清中Treg及Th17細胞含量比較見表1，2。

表1 各組血清中 Treg細胞含量比較

注：與對照組比較，①Plt;0.05；與輕中度慢性牙周炎比較②Plt;0.05。

表2 各組血清中Th17細胞含量的檢測結果比較

注：與對照組比較，①Plt;0.05；與輕中度慢性牙周炎比較②Plt;0.05。

3 討論

慢性牙周炎是發生在牙齦、牙周膜和牙槽骨等牙齒支持組織的一種常見的口腔感染性疾病,確切的發病機制仍未明了。然而牙周膜相關的微生物觸發宿主免疫應答，最終導致牙齒支持組織進行性喪失為慢性牙周炎發生的主要原因之一。CD4+T 細胞是參與免疫應答的一類重要細胞，在不同的微環境及細胞因子作用下可以分化成多種亞型，其中的Th17 細胞和調節性 T 細胞( Tregulatory cells，Treg) 在分化發育過程中受到多種細胞因子的調控，參與宿主的免疫應答，發揮促進或抑制炎癥反應的作用，均與牙周骨破壞有關[7]，是近年來有關慢性牙周炎免疫學發病機制的研究熱點。

本實驗對慢性牙周炎患者外周血中的Th17和 Treg細胞采用流式細胞術作為檢測手段，比較各型慢性牙周炎與牙周健康的對照組人群外周血中Th細胞亞群中的Terg ,Th17表達水平。我們的結果顯示牙周炎病人外周血中Terg ,Th17細胞比例升高，提示Terg,Th17介導的細胞免疫可能參與牙周炎的全身系統性免疫反應，并且推測兩者在外周血中高表達的水平與牙周炎發病關系密切。隨著慢性牙周炎病變程度的不同，Terg與Thl7的差異亦呈現顯著變化。重度慢性牙周炎組Terg,Th17在CD4+淋巴細胞比例明顯高于對照組。中度慢性牙周炎Terg在CD4+淋巴細胞比例略低于健康對照組，可能由于采血前病人進行過刮治影響了結果；輕度慢性牙周炎Terg在CD4+淋巴細胞比例接近于健康對照組；輕中度慢性牙周炎Th17細胞/CD4+細胞比例略高于健康對照組，但差異不大，無統計學意義。各組間相比較重度牙周炎Terg,Th17細胞在CD4+淋巴細胞比例明顯高于輕中度牙周炎，有統計學意義。Th17 細胞是近來研究發現的機體內存在的一種新型的輔助性 T 細胞亞群，因其可以分泌 IL-17，故被稱為 Th17 細胞。該細胞是由 Th0 細胞分化的，具有獨立的分化發育和調節機制。Th17 細胞介導炎性反應[10]，在自身免疫或免疫應答引起的組織破壞的發病機制中起到重要的作用[11-13]，并參與腫瘤和移植物抗宿主等疾病的發生和發展，決定疾病的轉歸和預后[14,8]。Treg 在慢性持續感染中發揮免疫抑制作用[15]。Treg 的免疫抑制作用雖然削弱了免疫系統的抗感染作用，但也避免了過度免疫應答對機體所產生的病理損害。Cardoso 通過免疫組化方法發現牙周健康者、牙齦炎和牙周炎的牙齦組織中均有 Treg 和其細胞因子 IL-10、TGF-β 的表達，且在牙周炎組織中的表達顯著增高[9]。

牙菌斑生物膜是牙周炎發生的始動因子,堆積在牙頸部和齦溝內的牙菌斑微生物及其毒性產物會刺激牙周組織導致牙周組織的破壞，并激活機體的免疫防御系統，毒性產物及其引發的炎性介質可以進入血液循環，牙周炎的進展及病變程度主要取決于宿主的免疫反應[16]。T 細胞是機體抗炎免疫應答中重要的反應細胞和效應細胞，研究表明，T 細胞與牙槽骨吸收及牙周炎的預后密切相關，活化 CD4 T 細胞產生的相關因子能夠影響牙周炎的病理性破骨細胞激活與分化[17]。健康的組織中存在 Th17/Treg細胞的平衡，Th17/Treg 細胞的失衡會導致破壞性的免疫反應[18]Th17 細胞和 Treg細胞在免疫應答中起相反作用[19]。促炎性Th17細胞與抑制性Treg細胞的失衡在炎癥及自身免疫病中是一個關鍵因素。在多種炎癥中檢測到 Th17 和Treg 的不同表達，認為 Th17和 Treg 對炎癥的發展起到重要的作用。Treg/Th17 和其所產生的細胞因子相互作用形成一個復雜的網絡。Ohlrich[2]等認為，Th17/Treg 失衡引起的自身免疫反應是造成牙周炎發生發展的因素之一。

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1.海南省自然科學基金(20158318)；2.海南醫學院科研培育基金(HY2014-009)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1965-04

2017-01-17)