丹皮酚對心肌缺血再灌注損傷大鼠模型腫瘤壞死因子-α和Toll樣受體4表達的影響

常 潔 夏中元 羅興均

(武漢大學人民醫院麻醉科，湖北 武漢 430200)

丹皮酚對心肌缺血再灌注損傷大鼠模型腫瘤壞死因子-α和Toll樣受體4表達的影響

常 潔 夏中元 羅興均1

(武漢大學人民醫院麻醉科，湖北 武漢 430200)

目的探討丹皮酚對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護中腫瘤壞死因子(TNF)-α及Toll樣受體(TLR)4 表達的影響。方法清潔級成年雄性SD大鼠36只隨機分為假手術組、 缺血再灌注組、 丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組每組9只；通過結扎左冠脈前降支30 min 再灌注2 h建立大鼠心肌缺血再灌注模型。通過TTC 染色法檢測大鼠梗死心肌體積；ELISA法檢測血液中TNF-α的含量；通過免疫組化法檢測缺血壞死心肌組織 TLR4 的表達。結果與缺血再灌注組相比，丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組心肌梗死體積減小，TNF-α表達減少;心肌組織 TLR4 水平明顯降低; 其中丹皮酚高劑量組更明顯。結論丹皮酚能夠明顯降低大鼠心肌缺血再灌注損傷，這種作用可能與減輕缺血再灌注中大鼠心肌TNF-α及TLR4表達有關。

丹皮酚；心肌缺血再灌注損傷；Toll樣受體4；腫瘤壞死因子-α

心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)可以導致細胞死亡、梗死范圍擴大加重，甚至出現不可逆的損傷，進一步造成心功能的損害并影響AMI患者的預后〔1〕。MI/RI的發病機制比較復雜，目前公認的機制有氧自由基、鈣超載、炎癥介質等〔2〕。Toll樣受體(TLR)4是一種天然免疫受體，在介導炎癥反應信號轉導中尤為重要。丹皮酚是中藥牡丹皮和徐長卿或全草的主要活性成分〔3〕。PA味苦、辛，呈白色針狀結晶，微溶于水，因此可以能隨水蒸氣揮發，可溶于乙醚、丙酮、乙醇、苯、氯仿、和二硫化碳〔4〕。國內外研究發現，丹皮酚作為一個多靶點藥物，其藥效溫和持久、具有半衰期短、不良反應少等特點，有鎮靜催眠、解熱、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、免疫調節等作用，因此應用前景廣泛。新近研究證實丹皮酚還具有中樞神經系統保護、誘導癌細胞凋亡及心血管系統保護作用，尤其在心血管方面的藥理作用越來越受到重視，有抗動脈粥樣硬化〔5，6〕、抗心肌缺血〔7～9〕、降血脂〔10〕、抗心律失常〔11，12〕、抗高血壓〔13〕等作用。楊正生等〔14〕通過研究證實PA通過拮抗鈣心肌細胞內鈣超載、延遲后去極、降低自由基活性等途徑發揮抗心律失常作用。張衛國等〔7〕證實丹皮酚能在心肌缺血再灌注損傷中減少心肌細胞游離脂肪酸含量，降低線粒體膜的膽固醇/磷脂，改善Ca2+-ATP酶活性并且增強線粒體膜脂的流動性；Nizamutdinova等〔8〕證實丹皮酚能在心肌缺血再灌注損傷中減輕梗死心肌面積并降低心肌凋亡而發揮改善MI/RI的作用；在心肌凋亡方面，丹皮酚可通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達及下調促凋亡蛋白Bax表達，干預并減少心肌細胞凋亡〔15〕。翟昌林等〔16〕觀察到丹皮酚能夠明顯降低心肌缺血組織高遷移率族蛋白(HMG)B1的表達，表明PA對MI/RI的保護作用及減少其梗死面積是通過降低缺血梗死心肌組織中HMGB1的表達、抑制炎癥因子路徑實現的。本研究通過觀察不同劑量丹皮酚對MI/RI中大鼠TLR4及TNF-α表達的影響，為臨床防治MI/RI提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗對象及分組 清潔級SD雄性大鼠36只，4～6月齡，體重220～280 g，武漢大學實驗動物中心提供，采用隨機數字表法隨機分為4組，每組9只：①假手術組：模型建立時只穿線不結扎；②缺血再灌注組：造模成功后120 min立即處死大鼠，采血以及收集心臟標本并進行相關指標的檢測。③丹皮酚低劑量組：術前給予丹皮酚腹腔注射，劑量為15 mg·kg-1·d-1，造模成功后將小鼠處死，采血以及收集心臟標本，對相關指標進行分析和檢測；④丹皮酚高劑量組：術前給予小鼠丹皮酚注射，劑量為15 mg·kg-1·d-1，構建了心肌缺血再灌注損傷模型后進行采學并且收集樣本。

1.2主要試劑和儀器 武漢博士德生物有限公司生產的ELISA檢測盒，浙江大學動物儀器廠生產的動物呼吸機，英國Abcam公司的TLR4兔多克隆抗體，山東魯南制藥廠的水合氯醛，浙江省華東醫藥股份公司的TTC試劑，MET-TLER公司的千分之一天平，日本Hitachi CF-5型低溫高速離心機以及OLYMPUS顯微鏡。

1.3大鼠缺血再灌注模型的制備 按參考文獻〔17〕的方法改進，采用冠脈結扎法建立MI/RI模型。取SD大鼠，術前12 h禁食不禁水，腹腔內注射濃度為10%的水合氯醛，將大鼠仰位固定，四肢連接十二導聯心電圖機，將頸部分離氣管后插入氣管插管，并且使用呼吸機保持小動物的呼吸順暢(呼吸頻率60次/min，潮氣量2 ml/100 g)；在胸骨左側第三肋間隙進行分離，分別在第3、4肋上環繞1根1號手術線，此時牽拉手術線讓肋骨得以撐開，沿著縱膈的方向將心包膜剪開，隨后將心臟暴露，沿左心耳下緣2～3 mm處用4-0帶線縫合針穿過，進針深度約0.1 cm，將一段直徑1.5 mm的乳膠管放置于結扎線下，此時收緊結扎線造成心肌缺血阻斷冠狀動脈的血流，隨后半個小時之后松開結扎線進行2 h的血液灌注形成缺血再灌注損傷模型，使用心電圖來分析模型構建的成功性，心電圖Ⅱ導聯ST段抬高或QRS波增高、增寬；松開后心臟ST段抬高超過1/2且出現了明顯波動異常的R波伴隨心律失常和病理性的Q波變化，即缺血再灌注損傷。

1.4梗死心肌TTC染色 于心肌缺血再灌注120 min后立即結扎冠脈，在頸動脈注射1%伊文思藍1 ml。待大鼠鞏膜藍染后迅速取下心臟，用PBS緩沖液沖洗干凈，剔除右心室、心房心肌組織，保留左心室，濾紙吸干，在-20℃的冰箱中冷存20 min。將心臟沿著心尖部分切片，將藍染部分和未藍染部分分別稱為危險區和梗死區，染色后梗死區域呈現為灰白色，計算梗死面積的范圍(IS/AAR%)以梗死心肌占缺血危險區心肌重量的百分比表示。

1.5ELISA法檢測血液中TNF-α的表達 再灌注120 min后采血，之后在離心機上以2 000 r/min離心20 min后，取其上清液于EP管-20℃保存以備檢測。針對小鼠實施雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗，嚴格按照大鼠TNF-α ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.6免疫組化檢測TLR4蛋白表達 每組隨機選取5只大鼠，采用免疫組化SABC法，DAB棕黃色反應呈色。在光學顯微鏡下觀察，心肌細胞胞質出現棕黃色均質顆粒為陽性。采用顯微圖像采集系統對免疫組化進行切片處理，并且放置在5個高倍顯微鏡下進行觀察，分析陽性細胞染色的平均積分光密度值，將TLR4值的蛋白含量和光密度值進行比對，蛋白含量越高，平均積分光密度的含量越高。

1.7統計學處理 采用SPSS13.0軟件組間比較行單因素分析，兩組間進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠心肌梗死體積比較 丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組心肌梗死體積較缺血再灌注組明顯降低(Plt;0.01)。其中，丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組之間亦有統計學差異(Plt;0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血液中TNF-α表達 與假手術組相比，缺血再灌注組中TNF-α的表達明顯增強，丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組明顯低于缺血再灌注組，丹皮酚高劑量組TLR4表達低于丹皮酚低劑量組(均Plt;0.05)。見表1。

2.3各組大鼠心肌壞死區組織TLR4表達 與假手術組相比，缺血再灌注組中TLR4的表達明顯增強，丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組明顯低于缺血再灌注組(Plt;0.05)，且丹皮酚高劑量組TLR4表達低于丹皮酚低劑量組(均Plt;0.05)。見表1。

表1 各組心肌梗死體積、血液TNF-α水平及心肌壞死區組織TLR4表達比較

與缺血再灌注組比較：1)Plt;0.01，2)Plt;0.05

3 討 論

心血管疾病，尤其急性心肌梗死是一種嚴重危害人類健康的疾病，血運重建對于挽救患者的壞死心肌和生命有重要意義；但再灌注自身能夠引起多項心肌變化，會對最終的治療結果產生影響，導致缺血性心肌損害的出現，從而導致心肌結構破壞和細胞死亡，從而誘發進一步的損傷，對患者的預后產生一定的損害效果。缺血性再灌注損傷的發病機制復雜，炎性反應、鈣超載、氧自由基等都在發病環節起到了一定的作用，也是當前公認的病發機制，尤其是炎癥反應更是MI/RI的重要誘發病因之一。隨著炎癥性反應的出現，大量的氧自由基和細胞因子出現，導致了血管通透性增加和水腫。近些年來，學者們在對果蠅進行分析時發現了TLR家族，這是一種細胞跨膜受體，作為一類重要的蛋白質分子參與了非特異性免疫，為特異性免疫與非特異性免疫間的橋梁，目前，在哺乳動物中已經發現11個TIRs家族成員，而人的TLRs家族基因定位分別是定(TLR1，2，3，6，10)4號染色體，9號染色體(TLR4)，1號染色體(TLR5)，3號染色體(TLR9)，x號染色體(TLR7，8)。其家族中尤其是TLR4是動物界中率先被發現的TLRs，TLRs在獲得性免疫中的具有識別作用。在免疫應答和信號轉移等過程中都發揮出了重要的作用。大量的研究結果也證實了在心血管疾病的發生發展和疾病轉歸過程中TLR4發揮出了重要的作用，是誘發缺血性再灌注損傷的重要因素之一〔18～20〕。在疾病的發展過程中，TLRs活化了IRAK-1和MyD88等途徑，從而導致了NF-κB活化，導致了一系列的炎性反應和核轉移現象，最終出現了炎癥反應〔21～23〕。在心肌缺血再灌注損傷中，前期研究結果證實TLR4在MI/RI中作為主要炎性介質發揮重要作用并可通過藥物干預降低TLR4釋放來減輕心肌缺血再灌注損傷帶來的心肌損害的〔24，25〕。本研究結果顯示丹皮酚在缺血性再灌注損傷過程中具備保護性的作用，這也符合Nizamutdinova等〔8〕的研究結果。本研究結果顯示，丹皮酚對于降低MI/RI過程中的TLR4表達有一定的作用，高劑量組的效果更加明顯。由此可見，可以使用丹皮酚實現降低心肌細胞梗死的目的，從而降低TNF-α的表達并保護缺血性心臟組織。由此可見，丹皮酚對于降低心臟組織中的TLR4及TNF-α表達有重要意義，可以明顯改善心肌缺血性再灌注損傷的狀況，改善心肌功能。

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〔2017-01-30修回〕

(編輯 徐 杰)

EffectofpaeonolonexpressionofTNF-αandTLR4inmyocardiumischemia-reperfusioninjuryinrats

CHANGJie,XIAZhong-Yuan,LUOXing-Jun.

DepartmentofAesthesiology,WuhanUniversityPeople′sHospital,Wuhan430060,Hubei,China

ObjectiveTo investigate the effect of paeonol (PA)on the expression of TNF-α and TLR4 in myocardium ischemia(MI)-reperfusion injury (RI) in rats.MethodsA total of 36 male SD rats were randomly divided into sham, ischemia reperfusion (IR), low-dose PA and high-dose PA groups, 9 rats in each group. And the rat MI/RI model was established by coronary artery ligation for 30 min followed by 120 min reperfusion. The myocardium infarction was measured by TTC staining. Blood TNF-α was detected by ELISA. The expression of TLR4 in ischemic myocardium was detected via immuno-histochemistry.ResultsCompared with IR group, myocardial infarction and the expression of TNF-α and TLR4 were reduced in low- and high-dose PA groups, the effects of high-dose PA were more obvious.ConclusionsPA could significantly reduce myocardial ischemia-reperfusion injury in rats, which may be related to reduce the expression of TNF-α and the expression of TLR4 in myocardium of ischemia-reperfusion rats.

Paeonol; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Toll-like receptor 4; Tumor necrosis factor-α

R54

A

1005-9202(2017)21-5222-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.003

國家自然科學基金(81201460)

1 十堰市人民醫院麻醉科

夏中元(1966-)，男，博士，主任醫師，教授，博士生導師，主要從事圍術期臟器保護研究。

常 潔(1985-)，女，碩士在讀，主治醫師，主要從事圍術期心肌保護研究。