微泡破壞促進骨髓間充質干細胞歸巢治療犬心肌梗死

常學鋒 于 淼 初貴富 馬大實

(北華大學附屬醫院急診科,吉林 吉林 132000)

微泡破壞促進骨髓間充質干細胞歸巢治療犬心肌梗死

常學鋒 于 淼1初貴富 馬大實2

(北華大學附屬醫院急診科,吉林 吉林 132000)

目的通過診斷超聲介導微泡破壞聯合冠狀動脈內移植促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)歸巢梗死心肌，為臨床治療心肌梗死探索新的方法。方法急性心肌梗死(AMI)造模成功犬隨機分為4組，每組6只，造模7 d后，分別給予磷酸鹽緩沖液(PBS)、超聲+微泡+PBS、BMSCs、超聲+微泡+BMSCs。28 d后，評估心功能和灌注缺損區域占左心室灌注區的百分比(DA%)，評估心肌梗死面積占左心室心肌橫斷面面積的百分比，BMSCs分化的心肌細胞數量及是否出現α-肌動蛋白。結果超聲+微泡+冠狀動脈移植BMSCs和單純冠狀動脈移植BMSCs均可縮小心肌梗死面積和灌注缺損面積、改善心功能和室壁運動異常指數(WMSI)、促進BMSCs在心肌內存活，但前者效果更顯著；兩者均可表達α-肌動蛋白，但前者α-肌動蛋白染色陽性的細胞數多于后者。結論診斷超聲介導微泡破壞聯合冠狀動脈內移植可以促進BMSCs歸巢梗死心肌，使更多的BMSCs抵達梗死區域分化為有功能的心肌細胞，從而降低心肌梗死面積并改善心臟功能。

心肌梗死；診斷超聲介導微泡破壞；骨髓間充質干細胞；冠狀動脈內移植

急性心肌梗死(AMI)是臨床常見的危重類型。最常用的AMI治療包括藥物治療和介入治療，但都不能增加心肌梗死后的心肌細胞數量〔1〕。研究表明，骨髓間充質干細胞(BMSCs)能夠分化為心肌組織和血管，減少組織纖維化和釋放旁分泌因子，最終逆轉左心室重塑〔2〕。最近的臨床試驗表明，移植的異體BMSCs與自體BMSCs同樣可以安全有效地用于心臟組織重建〔3〕。將足夠的BMSCs安全、準確地歸巢到梗死區對于其治療AMI的功效十分關鍵。通過同軸整體交換型球囊擴張(OTW)經梗死相關冠狀動脈移植的BMSCs不僅定位準確，而且風險較低，易于操作；診斷超聲介導的微泡破壞可以增加血管通透性，促進BMSCs歸巢到心肌梗死區〔4～6〕。

1 材料和方法

1.1試劑 二氨基聯苯胺(DAB)顯色酶底物試劑盒購自Boster(中國武漢)。 小鼠單克隆抗BrdU抗體購自美國的SANTA。 L-DMEM培養基購自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)，Percoll溶液購自Sigma(St.Louis，MO，USA)。 CD34和CD44兔單克隆抗體購自Dingguo Biotechnology(中國北京)。 2.5 mm×15 mm OTW球囊購自Medtronic(Minneapolis，MN，USA)。

1.2BMSCs 準備 穿刺取骨髓：將犬以5%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔麻醉后，用注射器穿刺犬肱骨，抽取10 ml骨髓并與等體積肝素混合。通過Percoll密度梯度離心純化BMSCs，將獲得的單核細胞接種在100 mm的培養皿中，培養液包含有20%磷酸鹽緩沖液(PBS)、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的L-DMEM，在5%CO2， 37.0℃下培養。 24 h后更換培養基以除去非黏附細胞(如紅細胞和巨噬細胞)。細胞生長至70%以上時進行傳代。細胞以1∶3的比例傳代，每2 d更換培養基。 所有測定用第3代細胞進行，隨后用MTT比色測定分析培養細胞的生長規律。通過CD34和CD44陽性細胞的免疫組織化學染色鑒定BMSCs。在移植前24 h加入10 μl BrdU標記液以標記BMSCs。

1.3AMI模型的制作 造模組禁食8 h后用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉實驗動物。以Sedinger技術穿刺右側股動脈，置入6F鞘管。選6F造影導管自右股動脈插至主動脈根部，注入少量造影劑優維顯370顯示冠狀動脈前降支(LAD)。選用BMW導絲送至前降支遠端，推送6FOTW球囊導管，使之抵達第一間隔支和第二間隔支之間，離LAD和左回旋支(LCX)分叉處0.5～1.0 cm，注入適量造影劑，以4～6 amt充盈球囊堵塞冠狀動脈前降支4 h后撤除氣囊，造模完畢。

1.4方法 從吉林省中醫藥科學院實驗動物中心獲得12只雄性和12只雌性健康比格犬(體重15.0～18.0 kg)。造模7 d后將犬隨機分為4組，每組6只，雌雄各半，(1)PBS組：確定目標冠狀動脈即前降支開口后用5 ml生理鹽水進行沖洗，采用帶有中心腔的OTW球囊將冠狀動脈近端邊緣完全堵塞后由遠及近于2 min內注射PBS。(2)超聲+微泡+PBS組：冠狀動脈造影確定目標冠狀動脈即前降支開口，給予超聲輻射：經股靜脈應用微量泵以1.5 ml/min的速度勻速緩慢靜脈注射2.0 ml聲諾維，注入聲諾維時啟動超聲：采用VIVID 7D 3S探頭，頻率為1 MHz，強度為1.0 W/cm2，時間觸發模式，觸發脈沖持續時間23 ms，幀頻(FPS)為0.5，觸發時間間隔為2 s，機械指數(MI)1.3，作用時間10 min，深度8～10 cm，超聲探頭固定于犬心臟左室乳頭肌水平，觀看短軸切面圖。隨后操作同PBS組。(3)BMSCs組：以BMSCs取代PBS，余操作同PBS組。(4)超聲+微泡+BMSCs組：以BMSCs取代PBS，余操作同超聲+微泡+PBS組。

1.5評價 (1)造模時注入適量造影劑于指引導管內，觀看錄像，造影劑是否被阻于氣囊近端，以證明血流有無阻斷。(2)M型超聲、二維超聲心動圖及MCE測量心功能、DA%：M型超聲測量心功能，包括舒張末期容積(EDV)、收縮末期容積(ESV)、左室射血分數(LVEF)、短軸縮短率(FS)、室壁增厚率(D%)、室壁運動異常指數(WMSI)。MCE測量DA%。分別于造模前及造模后4 h、梗死相關冠狀動脈再通后分別進行心肌造影。選擇每次造影心肌顯影達平臺時灌注缺損面積最小的圖像，應用自編的Matlab軟件計算DA%。(3)病理和免疫組化分析：給予PBS或BMSCs 28 d后，將犬用心內注射氯化鉀處死，取出心臟，找到冠脈LAD阻斷點，將阻斷水平以下心肌做連續橫斷面切片，做病理學分析和免疫組化。病理分析采用NBT染色。計算各實驗組心肌梗死面積占左心室心肌橫斷面面積的百分比。免疫組化分析α-肌動蛋白和BrdU染色細胞。

1.6統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1心功能和DA%的測量 各組AMI造模成功：各組造模后4 h較造模前心臟功能顯著降低，DA%顯著增加(均Plt;0.05)。見表1。MCE同步心電圖導聯V1表現出特征性AMI變化，包括弓背向上抬高的ST段與直立的T波連接以形成單個曲線和病理Q波(圖1)。超聲+ BMSCs組和BMSCs組在BMSCs移植后心臟功能和DA%較其余兩組均有顯著改善，且前者較后者改善更為顯著(均Plt;0.05)；其余兩組心臟功能和DA%較造模4 h沒有改善(Pgt;0.05)。見表2。

表1 心肌梗死造模前后各組心功能、WMSI及DA%比較

與同組造模前比較：1)Plt;0.05

A、C、E、G、I、K為DA%，B、D、F、H、J、L為心功能；A、B為造模；C、D為造模后4 h；E～L為給予PBS或BMSCs 28 d后其中E、F為PBS組，G、H為超聲+微泡+PBS組，I、J為BMSCs組，K、L為超聲+微泡+BMSCs組圖1 不同實驗階段各組DA%和心功能

組別EDV(ml)LVEF(%)FS(%)DA%D%WMSIPBS組67.00±4.381)2)36.50±5.051)2)18.50±4.811)2)11.19±1.431)2)9.83±5.081)2)3.17±1.171)2)超聲+微泡+PBS組71.83±4.491)2)37.17±5.041)2)17.67±4.801)2)11.25±1.881)2)12.17±6.371)2)3.17±0.981)2)BMSCs組37.33±4.371)53.17±5.041)28.50±4.761)7.11±1.631)21.67±5.471)2.00±0.001)超聲+微泡+BMSCs組30.50±4.2365.83±5.1937.17±4.714.56±1.1330.50±6.191.50±0.55

超聲+微泡+BMSCs組分別與其余各組比較:1)Plt;0.05；BMSCs組分別與超聲+微泡+BMSCs以外各組比較:2)Plt;0.05

2.2病理檢查結果 NBT染色結果顯示，與BMSCs，超聲+ PBS和PBS組相比，超聲+ BMSCs組梗死面積分別減少了35.9%、59.5%和59.2%(Plt;0.05)。 與超聲+ PBS和PBS組相比，BMSCs組分別減少了36.7%和36.4%(Plt;0.05)。見圖2。

A.PBS組；B.超聲+微泡+PBS組；C.BMSCs組；D.超聲+微泡+BMSCs組圖2 各組NBT染色

給予PBS或BMSCs28 d后各組與MCE相同切面水平的橫斷面心肌梗死面積占左心室心肌橫斷面面積的百分比分別為：PBS組(11.18±1.43)%，超聲+微泡+PBS組(11.24±1.87)%，BMSCs組(7.11±1.60)%，超聲+微泡+BMSCs組(4.56±1.09)%。

BrdU染色顯示，在BMSCs移植后第28天，超聲+微泡+ BMSCs組和BMSCs組BrdU陽性細胞數分別為270.83±18.41和168.50±19.41，超聲+微泡+ BMSCs組明顯高于BMSCs組(Plt;0.05)。見圖3。

圖3 不同組BrdU陽性細胞

2.3各組α-肌動蛋白染色陽性的心肌細胞數 α-肌動蛋白染色陽性的證據為細胞質被染為棕黃色。各組α-肌動蛋白染色陽性的心肌細胞數由多到少依次為超聲+微泡+BMSCs組、BMSCs組、超聲+微泡+PBS組、PBS組，其中后2組在心肌梗死區域幾乎沒有α-肌動蛋白染色陽性的細胞(圖4)。

圖4 各組α-肌動蛋白染色陽性的心肌細胞

3 討 論

本研究結果表明，BMSCs的移植增加了能夠有效收縮的心肌細胞數量，減少了心肌梗死面積和灌注缺陷面積，改善了心臟功能。心肌梗死發生后病變局部的微環境是細胞存活的最關鍵因素，它將影響移植細胞的黏附、遷移和定殖能力及長期存活〔7〕。Kuethe等〔8〕發現在心肌梗死后第7天，血管內皮生長因子VEGF的分泌達到高峰；而且在心肌梗死7～15 d之后，炎癥反應較前減弱，纖維組織開始形成但又沒有完全形成，此時移植細胞容易存活。本研究結果也證實了BMSCs移植后能夠存活和分化。本研究結果提示超聲+微泡+冠狀動脈移植BMSCs和單純冠狀動脈移植BMSCs均可縮小心肌梗死面積和灌注缺損面積、改善心功能，促進BMSCs在心肌內存活，表達α-肌動蛋白且前者效果更顯著。

1Sanz-Rosa D,García-Prieto J, Ibanez B.The future:therapy of myocardial protection〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2012;1254:90-8.

2Williams AR,Hare JM.Mesenchymal stem cells:biology,pathophysiology,translational findings,and therapeutic implications for cardiac disease〔J〕.Circ Res,2011;109:923-40.

3Hare JM,Fishman JE,Gerstenblith G,etal.Comparison of allogeneic vs.autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy〔J〕.JAMA,2012;308:2369-79.

4Vulliet PR,Greeley M,Halloran SM,etal.Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs〔J〕.Lancet,2004;363:783-4.

5Yoshida J,Ohmori K,Takeuchi H,etal.Treatment of ischemic limbs based on local recruitment of vascular endothelial growth factor-producing inflammatory cells with ultrasonic microbubble destruction〔J〕.Coll Cardiol,2005;46:899-905.

6Imada T,Tatsumi T,Mori Y,etal.Targeted delivery of bone marrow mononuclear cells by ultrasound destruction of microbubbles induces both angiogenesis and arteriogenesis response〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005;25:2128-34.

7Wollert KC,Drexler H.Clinical application of stem cells for the heart〔J〕.Circ Res,2005;96:151-63.

8Kuethe F,Figulla HR,Herzau M,etal.Treatment with granulocyte colony-stimulating factor for mobilization of bone marrow cells in patients with acute myocardial infarction〔J〕.Heart,2005;150-5.

〔2017-04-11修回〕

(編輯 郭 菁)

R542

A

1005-9202(2017)21-5228-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.005

吉林省衛生計生科研計劃(20152057)；吉林市醫療衛生指導性計劃項目(201737056)

1 吉林大學第一醫院放射線科 2 吉林大學第一醫院心臟外科

馬大實(1972-)，男，副教授，碩士，主要從事心臟疾病研究。

常學鋒(1973-)，男，副主任醫師，主要從事急診內科及心內科研究。