游泳耐力運動對小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1信號通路的影響

陳 瑋 萬紹勇 王 煒 龍曉東 陶干臣

(江西中醫藥大學體育教學部，江西 南昌 330004)

游泳耐力運動對小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1信號通路的影響

陳 瑋 萬紹勇1王 煒1龍曉東1陶干臣1

(江西中醫藥大學體育教學部，江西 南昌 330004)

目的探討游泳耐力運動對小鼠骨骼肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息調節因子2相關酶(SIRT)1信號通路的影響。方法選取SPF級雄性小鼠24只，按照隨機數字表法分為對照組和模型組各12只。采用皮下注射5 mg/kg的地塞米松磷酸鈉注射液建造肌肉衰減綜合征小鼠模型，每天0.1 ml/10 g，連續注射6 w。建模成功后再根據隨機數字表法將對照組分為正常對照組和耐力運動對照組各6只，模型組分為正常模型組和耐力運動模型組各6只，耐力運動對照組和耐力運動模型組進行相應的游泳耐力運動訓練。評價模型組小鼠建模情況。對比小鼠骨骼肌中AMPK mRNA、AMPK蛋白和SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白表達情況。結果模型組小鼠建模成功，小鼠跑臺掉下次數顯著多于對照組，游泳速度和筋肉含量顯著低于對照組(Plt;0.05)。耐力運動模型組小鼠的AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA、SIRT1 mRNA均顯著高于正常對照組、耐力運動對照組、正常模型組(Plt;0.05)，耐力運動對照組AMPKα2 mRNA高于正常對照組和正常模型組(Plt;0.05)。耐力運動對照組和耐力運動模型組AMPK蛋白均顯著高于正常對照組和正常模型組(Plt;0.05)。結論肌肉衰減綜合征小鼠筋肉含量減少，運動能力下降，同時游泳耐力訓練可增加肌肉衰減綜合征小鼠的AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA、SIRT1 mRNA水平，同時增加AMPK蛋白水平，其具體機制還有待進一步研究。

游泳耐力運動；骨骼肌；腺苷酸活化蛋白激酶；沉默信息調節因子2相關酶1

肌肉衰減綜合征是伴隨著年齡增長而出現的進行性骨骼肌量減少、伴有肌肉力量和(或)肌肉功能減退的綜合征，以骨骼肌細胞體積和數量減少、結締組織和脂肪增多為主要特征，患者表現為軀體功能下降、虛弱及不同程度殘疾〔1〕。據流行病學調查顯示〔2〕，肌肉衰減綜合征的多發群體為60歲以上的老年人，當年齡gt;80歲后發病率將逐漸增加，部分地域可達50%。老年人肌肉衰減綜合征除引起骨骼肌量減少，力量減弱，運動和平衡能力下降，跌倒風險增加外，還更容易患上糖尿病、關節炎、骨質疏松、心臟病等疾病。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)具有調節脂肪、蛋白質和糖代謝的作用，能維持細胞能量穩態〔3〕。沉默信息調節因子2相關酶(SIRT)1是一種與細胞生長周期調節、胰島素分泌、 能量代謝、細胞衰老等密切相關的去乙酰化酶，是機體內重要的能量代謝感受器〔4〕。本研究通過對照實驗來探討游泳耐力運動對小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取SPF級雄性小鼠24只，體重27.8～33.4 g，平均(30.4±2.1)g。飼養環境溫度保持在20℃～25℃，濕度控制在55%左右，每天給予12 h光照，保持通風，分4籠喂養，每籠6只，正常喂養1 w，期間所有小鼠均自由飲食、飲水。實驗小鼠購于南京君科生物工程有限公司。

1.2實驗儀器和藥品 地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，氯仿、異丙醇(天津市華東試劑廠)，焦碳酸二乙酯、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、一抗、二抗(上海翊圣生物科技有限公司)，裂解液、超敏電化學發光(ECL)試劑盒、Tris鹽酸緩沖液(TBST，上海優寧維生物科技公司)。

1.3分組方法和模型建造 在正常飼養1 w后，采用隨機數字表法將24只小鼠隨機分為對照組(12只)和模型組(12只)。其中對照組小鼠分組后繼續正常飲食6 w，不做其他特殊處理。模型組小鼠建模方式如下〔5〕：每天給予皮下注射5 mg/kg的地塞米松磷酸鈉注射液，0.1 ml/10 g，連續注射6 w。6 w后再根據隨機數字表法將對照組分為正常對照組(6只)和耐力運動對照組(6只)，模型組分為正常模型組(6只)和耐力運動模型組(6只)。其中耐力運動對照組和耐力運動模型組均進行游泳耐力運動，無負重，每天訓練1 h，每周訓練5 d(訓練5 d后休息2 d)，共訓練6 w，期間正常飲食、飲水。正常對照組和正常模型組不做任何訓練，期間正常飲食、飲水。

1.4模型評定標準 在模型組小鼠建模結束后對所有小鼠進行游泳測試和輪式跑臺測試，對比對照組和模型組小鼠的游泳速度和從跑臺掉下的次數。同時使用小動物體成分分析儀檢測所有小鼠的筋肉含量。若建模小鼠的游泳速度、掉下次數和筋肉含量與正常小鼠相比有統計學差異則提示建模成功。同時觀察所有小鼠的毛發、精神狀態、反應速度、食欲等情況。

1.5mRNA和蛋白的測定方法 在耐力運動對照組和耐力運動模型組小鼠末次訓練結束后，所有小鼠禁食12 h后處死，將骨骼肌組織分離，裝于標記好的試管中，置入液氮中速凍，后置于-80℃的環境中保存。采用實時定量熒光PCR(Real-Time PCR)法檢測AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA和SIRT1 mRNA的水平。先取部分骨骼肌組織進行研磨，加入Trizol試劑1 ml，震蕩搖勻，在4℃下12 000 r/min離心15 min。取其上清液，加入氯仿200 μl，震蕩搖勻，直至呈現乳白色，4℃ 12 000 r/min離心15 min， 取其上清液，加入500 μl異丙醇，震蕩搖勻，置于0℃ 20 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min。將上清液舍去，加入75%乙醇1 ml，4℃ 12 000 r/min離心15 min，重復一次此步驟。將上清液舍去，于室溫中靜置5～7 min。加入焦碳酸二乙酯20～30 μl，65℃水浴10 min。PCR引物序列分別為AMPKα1 mRNA上游引物：ACCTGACTCTTTCCTGGACG，下游引物：AATGCCATTTTGCCTTCCGT；AMPKα2 mRNA上游引物：CGCCTCTAGTCCTCCATCAG，下游引物：TTGGGCTTCGTTGTGTTGAG；SIRT1 mRNA上游引物：ACAGTGAGAAAATGCTGGC，下游引物：GCCACTGTCACTGTTACTGC。取部分骨骼肌組織進行研磨，加入裂解液0.35 ml，震蕩搖勻，12 000 r/min離心20 min，取其上清液，加入適量BCA工作液，于37℃下干燥30 min。進行凝膠電泳，后轉移于聚偏二氟乙烯膜上，10%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋好的一抗，4℃孵育過夜。后加入稀釋好的二抗，室溫孵育二抗1 h，采用TBST緩沖液充分洗滌，后使用超敏ECL試劑盒顯影，膠片曝光，掃描定量各信號條帶的相對灰度值。

1.6統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t、χ2檢驗。

2 結 果

2.1建模情況 模型組小鼠的跑臺掉下次數顯著多于對照組，游泳速度和筋肉含量顯著低于對照組(Plt;0.05)，說明模型組小鼠建模成功。對照組小鼠毛發有關澤，精神狀態良好，運動較多，食欲較強，對外界刺激反應較快，無異常死亡。模型組大鼠毛發雜亂且光澤差，精神狀態較差，較少運動，食欲減退，對外界刺激反應較慢，無異常死亡。見表1。

2.2小鼠骨骼肌中AMPK mRNA和AMPK蛋白表達情況對比 見表2。耐力運動模型組小鼠AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA均顯著高于正常對照組、耐力運動對照組、正常模型組(Plt;0.05)，

表1 對照組和模型組小鼠游泳速度、跑臺掉下次數和筋肉含量比較

表2 小鼠骨骼肌中AMPK mRNA和AMPK蛋白表達比較

與正常對照組比較：1)Plt;0.05；與耐力運動對照組比較：2)Plt;0.05；與正常模型組比較：3)Plt;0.05，下表同

耐力運動對照組AMPKα2 mRNA高于正常對照組和正常模型組(Plt;0.05)。耐力運動對照組和耐力運動模型組的AMPK蛋白均顯著高于正常對照組和正常模型組(Plt;0.05)。

2.3小鼠骨骼肌中SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表達對比 耐力運動模型組小鼠SIRT1 mRNA顯著高于正常對照組、耐力運動對照組、正常模型組(Plt;0.05)，4組SIRT1蛋白水平兩兩比較差異均無統計學意義(Pgt;0.05)。見表3。

表3 小鼠骨骼肌中SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表達比較

3 討 論

肌肉衰減綜合征的具體發病過程復雜多變，細胞凋亡、內分泌因素、蛋白質合成減少、營養不良、炎癥反應、線粒體功能障礙等均可能涉及其中。運動和合理飲食是防治肌肉衰減綜合征的有效手段，在每天攝入的食物中要注重營養均衡，特別是要加強蛋白質的攝入，同時適當進行簡單的抗阻力運動和耐力訓練，可有效延緩肌肉衰減綜合征的發生〔6〕。AMPK、SIRT1是機體內重要的能量代謝感受器,可感知體內的能量代謝狀態,并通過調控下游分子的基因表達或活性來對機體能量代謝過程進行調節〔7〕。有氧運動可直接對骨骼肌造成良性影響，可以增加骨骼肌有氧代謝酶類濃度，提高骨骼肌利用糖、脂肪的代謝能力，同時提高脂肪供能的比例，有氧運動還可以使得肌細胞內線粒體的數量和體積得到增加。通過運動可激活骨骼肌AMPK/SIRT1信號通路，提升線粒體氧化能力和生物合成能力提，進而改善骨骼肌肌肉質量〔8〕。

本研究結果提示模型組小鼠建模成功，同時患有肌肉衰減綜合征的小鼠筋肉含量下降，運動能力減退，進而對身體各項機能造成影響，包括食欲減退、營養不良、反應速度變慢等。另外說明游泳耐力運動可以提升小鼠骨骼肌AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA、SIRT1 mRNA的水平，同時可以提高小鼠骨骼肌AMPK蛋白水平。AMPK在真核細胞生物中廣泛存在,能感知細胞能量代謝狀態的改變,并通過影響細胞物質代謝的多個環節維持細胞能量供求平衡〔9〕。SIRT1與細胞的能量代謝同樣存在著密切的關系，當熱量限制時，SIRT1水平升高,進而延長生物體的衰老過程〔10〕。研究表明〔11〕，AMPK與SIRT1可能存在著內在聯系,從而在調節能量代謝過程中起著重要的調控作用。AMPK是一種異源三聚體蛋白，有AMPKα、AMPKβ、AMPKγ 3個亞型，其中AMPKα又可分為AMPKα1、AMPKα2，骨骼肌纖維中以AMPKα2為主要表現形式。當小鼠在進行游泳耐力運動時，AMPK可受到多種信號通路的刺激，同時絲氨酸-蘇氨酸激酶11可激活AMPK，肌纖維收縮時可促進鈣離子釋放，均能使AMPK表達增加，此外AMPK可激活SIRT1，提高SIRT1活性〔12〕。有研究結果顯示〔13〕，骨骼肌的衰老與線粒體的數量和活性存在相關性，小鼠在進行游泳耐力運動時需要消耗大量腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，這就需要提升線粒體的數量和活性，在運動時機體應激激活骨骼肌AMPK/SIRT1信號通路，促進過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子(PGC)-1α表達，同時提高PGC-1α的活性，提升線粒體的氧化磷酸化功能，進而增加ATP的合成，滿足機體的供能需求。

1熊偉平,夏 志.有氧運動促進老年前期小鼠快縮型骨骼肌蛋白質合成代謝的研究〔J〕.中國康復醫學雜志,2016;31(12):1311-7.

2韓佩佩,郭 琪,潘 翔,等.老年人肌肉衰減綜合征的診斷標準與運動療法〔J〕.中國康復醫學雜志,2015;30(3):290-4.

3Hu M,Liu B.Retraction notice to:resveratrol attenuates lipopolysaccharide-induced dysfunction of blood-brain barrier in endothelial cells via AMPK activation〔J〕.Korean J Physiol Pharmacol,2017;21(2):277.

4周 蓉,王奇敏,張 成,等.大鼠腦干在不同低氧狀態下沉默信息調節因子2相關酶1水平檢測及其意義〔J〕.中華結核和呼吸雜志,2014;37(5):352-5.

5魯飛翔,李 軍,周仙杰,等.地塞米松致小鼠肌肉衰減綜合征模型建立〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(22):5542-4.

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7金 鑫,張會欣,張彥芬,等.津力達對高脂誘導的胰島素抵抗ApoE-/-小鼠骨骼肌甘油三酯相關酶的影響〔J〕.中國實驗動物學報,2015;23(1):69-74.

8楊 艷.補充白刺多糖聯合有氧運動對衰老大鼠心肌和骨骼肌的保護作用〔J〕.西南師范大學學報(自然科學版),2016;41(9):11-6.

9張 坦,崔 迪,張 喆,等.游泳運動對糖尿病小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1/NF-κB炎癥信號通路的影響〔J〕.體育科學,2016;36(9):40-7.

10Lin N,Li XY,Zhang HM,etal.microRNA-199a-5p mediates high glucose-induced reactive oxygen species production and apoptosis in INS-1 pancreatic β-cells by targeting SIRT1〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2017;21(5):1091-8.

11李 格,張 纓.低氧訓練誘導AMPK對小鼠骨骼肌PPARα表達的影響〔J〕.山東體育學院學報,2013;29(5):40-6.

12Han JY,Lee S,Yang JH,etal.Korean red ginseng attenuates ethanol-induced steatosis and oxidative stress via AMPK/Sirt1 activation〔J〕.J Ginseng Res,2015;39(2):105-15.

13趙永才.運動干預骨骼肌、心肌線粒體動力學研究現狀——心肌線粒體動力學研究展望〔J〕.體育科學,2016;36(11):75-81,96.

〔2017-03-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R39

A

1005-9202(2017)21-5231-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.006

江西省教育廳科學技術青年項目(No.GJJ160754)

1 井岡山大學體育學院

萬紹勇(1981-)，男，碩士，副教授，主要從事運動訓練與康復研究。

陳 瑋(1981-)，男，碩士，講師，主要從事運動訓練與康復研究。