清胰Ⅱ號對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺及腸組織中MCP-1表達的影響

尚獻會 李建國 范振海 兌丹華

(遵義醫學院附屬醫院小兒普胸泌外科，貴州 遵義 563003)

清胰Ⅱ號對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺及腸組織中MCP-1表達的影響

尚獻會 李建國1范振海2兌丹華3

(遵義醫學院附屬醫院小兒普胸泌外科，貴州 遵義 563003)

目的探究清胰Ⅱ號對重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺及腸組織中單核細胞趨化蛋白(MCP)-1表達及細胞凋亡的影響。方法將36只大鼠隨機分為對照組、模型組、模型+清胰Ⅱ號組，每組12只，對照組正常飼養，其余各組采用膽胰管逆行注射牛磺膽酸鈉0.1 ml/100 g的方法建立SAP模型，模型+清胰Ⅱ號組造模后給予清胰Ⅱ號10 ml/kg。造模后12、24 h隨機選取7只大鼠采樣，比較各組腹水量、胰腺和回腸病理學變化，判斷造模是否成功。酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清MCP-1、白細胞介素(IL)-10、二胺氧化酶(DAO)、血清淀粉酶(AMY)活力。實時定量PCR(qRT-PCR)檢測胰腺及腸組織中MCP-1 mRNA表達情況。流式細胞術檢測胰腺細胞的凋亡率。結果模型組大鼠腹內血性腹水及胰腺壞死顯著高于對照組，表明造模成功。造模后12、24 h，模型+清胰Ⅱ號組大鼠血性腹水、血清MCP-1、IL-10、DAO、AMY活力及胰腺、回腸組織中MCP-1 mRNA的表達顯著低于模型組(Plt;0.05)；與對照組相比，模型組及模型+清胰Ⅱ號組胰腺細胞的凋亡率顯著增加，且模型+清胰Ⅱ號組SAP顯著高于模型組(Plt;0.05)。結論清胰Ⅱ號可下調炎癥因子MCP-1、IL-10表達，降低DAO、AMY活力，促進胰腺細胞凋亡，對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺及腸組織具有良好的修復和保護作用。

清胰Ⅱ號；重癥急性胰腺炎；二胺氧化酶；單核細胞趨化蛋白-1

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種臨床常見的急性炎癥性疾病，主要發生在胰腺組織，可由多種原因引起〔1〕。SAP患者常伴發急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、全身炎癥反應綜合征等，易導致腸黏膜損傷及功能障礙，與多種炎癥介質如白細胞介素(IL)-10、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1瀑布樣級聯反應密切相關〔2〕。目前，臨床診斷和治療水平取得了較大的進步，但SAP患者的死亡率仍達30%～50%〔3〕。清胰Ⅱ號是一種由梔子、木香、赤芍、大黃、芒硝等制成的中藥復方制劑，具有疏肝清熱，殺蟲驅蛔的功效。研究表明清胰Ⅱ號顆粒劑能夠減輕SAP早期的損傷反應，保護胰臟、腎臟、腸道功能〔4～7〕。研究發現，清胰Ⅱ顆粒劑能夠抑制胰臟出血、壞死和并發多器官功能障礙綜合征的發生，對組織細胞起保護功能〔8〕。本文利用SAP模型大鼠，探究清胰Ⅱ號對其胰腺及腸組織中IL-10、MCP-1、細胞凋亡等的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗主要試劑和器材 ?；悄懰徕c購自美國Sigma公司；10%水合氯醛、清胰Ⅱ號顆粒劑購自遵義醫學院附屬醫院；烏拉坦購自武漢勝天宇生物科技有限公司；MCP-1、IL-10、二胺氧化酶(DAO) 酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司；血清淀粉酶(AMY)試劑盒購自上海滬震實業有限公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司。BX51-P偏光顯微鏡購自上海巴玖實業有限公司，定量PCR儀購自瑞士Roche公司，流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2實驗動物與SAP大鼠模型的建立 36只SPF級SD大鼠購自重慶第三軍醫大學實驗動物中心，8～12周齡，體質量(200.39±40.39)g，雌雄各半。動物飼養在溫度22℃～25℃、濕度55%～60%的環境中，自由飲食和飲水。實驗隨機分為對照組、模型組、模型+清胰Ⅱ號組。實驗干預前禁食12 h。參考康新等〔9〕的建模方法，模型組、模型+清胰Ⅱ號組大鼠采取膽胰管逆行給予?；悄懰徕c0.1 ml/100 g建立SAP模型，對照組給予等量的生理鹽水。造模后24 h注射10%水合氯醛0.3 ml/100 g處死，蘇木素-伊紅(HE)染色并記錄大鼠腹水量，光鏡下觀察胰腺、回腸病理形態學變化判斷造模是否成功。

1.3藥物干預 模型+清胰Ⅱ號組大鼠造模后給予清胰Ⅱ號顆粒劑10 ml/kg，6 h重復灌胃1次，共3次。對照組與模型組在相同時間給予等量生理鹽水灌胃。

1.4檢測血清中MCP-1、IL-10、DAO、AMY水平的變化 造模后12、24 h，各組隨機選取6只大鼠，采用0.5 ml/100 g 20%烏拉坦麻醉，原切口入腹，下腔靜脈取血5 ml，室溫靜置30 min，待出現淡黃色液體時，2 000 r/min離心15 min，取上清液置于EP管，根據ELISA檢測試劑盒說明書檢測各組大鼠血清MCP-1、IL-10、DAO、AMY水平。

1.5檢測胰腺和回腸組織MCP-1 mRNA表達量 采用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測胰腺和回腸組織MCP-1 mRNA表達情況。MCP-1基因的引物由上海生工生物有限公司合成，上游序列為5′-CACGTCGTAGCAAACCACCAA-3′，下游序列為5′-GTTGGTTGTCTTTGAGATCCA-3′。造模后12、24 h后取部分胰腺、回腸組織置于液氮中。加入1 ml Trizol提取胰腺和回腸組織中的總RNA并以根據逆轉錄試劑盒說明書將所提取RNA反轉錄為cDNA，GAPDH為參照，采用20 μl體系進行擴增。擴增條件為預變性94℃ 60 s，94℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 10 s，50個循環。實驗重復3次，采用2-ΔΔCt定量分析方法計算MCP-1 mRNA相對表達量。

1.6檢測大鼠胰腺細胞凋亡率 將所取部分胰腺組織置于平

皿中，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈，將胰腺組織剪成小塊后勻漿，使用200目尼龍網過濾，125 r/min離心5 min，PBS清洗3次，300目尼龍網過濾后，500 r/min離心5 min，收集細胞。加入100 μl 1×膜聯蛋白-V(Annexin V)緩沖液懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)，輕輕振蕩混勻，室溫避光反應10～15 min，加入400 μl 1×Annexin V緩沖液，混勻后置于流式細胞儀中1 h內檢測細胞的早期凋亡率。

1.7統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1觀察小鼠基本外觀和胰腺、回腸病理形態學變化 造模后12、24 h，與對照組相比，模型組、模型+清胰Ⅱ號組大鼠血性腹水體積顯著增加；模型+清胰Ⅱ號組〔(4.85±0.58)ml,(3.02±0.31)ml〕顯著低于模型組〔(8.20±1.03)ml、(9.11±1.13)ml〕(Plt;0.05)。

對照組胰腺、回腸組織基本正常，模型組大鼠回腸出現明顯水腫、間質血管充血、出血及中性粒細胞浸潤，胰腺小葉結構紊亂，細胞腫脹、壞死、出血；模型+清胰Ⅱ號組大鼠回腸、胰腺組織結構較為完整，壞死病灶、間質血管充血現象較輕，周圍有少量中性粒細胞浸潤，提示造模成功。見圖1。

圖1 造模后12、24 h三組大鼠胰腺光鏡HE染色(×400)

2.2檢測血清中IL-10、DAO、AMY水平 與對照組相比，模型組、模型+清胰Ⅱ號組大鼠在12、24 h時間點血清IL-10、DAO、AMY活力水平顯著增高(Plt;0.05)；與模型組相比，模型+清胰Ⅱ號組均顯著降低(Plt;0.05)。隨著時間的延長，模型組均逐漸升高，但模型+清胰Ⅱ號組均逐漸降低。見表1。

表1 檢測大鼠血清中IL-10、DAO、AMY水平

與對照組比較：1)Plt;0.05;與模型組比較：2)Plt;0.05；下表同

2.3大鼠血清、胰腺及腸組織中MCP-1表達量的變化 與對照組相比，模型組、模型+清胰Ⅱ號組大鼠血清MCP-1蛋白和胰腺及回腸組織MCP-1 mRNA的表達量均顯著增加(Plt;0.05)；模型+清胰Ⅱ號組均顯著低于模型組(Plt;0.05)。隨著時間的延長，模型組均逐漸升高，但模型+清胰Ⅱ號組均逐漸降低。見表2。

表2 大鼠血清、胰腺及腸組織中MCP-1表達量的變化

2.4大鼠胰腺細胞凋亡率的檢測 造模后12、24 h，模型組、模型+清胰Ⅱ號組大鼠胰腺細胞凋亡率顯著高于對照組(Plt;0.05)；與模型組相比，模型+清胰Ⅱ號組顯著增加(Plt;0.05)。見表3。

表3 大鼠胰腺細胞凋亡率的檢測

3 討 論

SAP患者體內胰腺自身防御機制障礙，導致胰管阻塞，大量胰酶分泌，誘發胰酶消化自身周圍組織，引起局部或全身的炎癥反應，甚至使全身多器官發生損傷。多種炎性因子參與SAP的發生、發展，發生瀑布樣級聯反應。IL-10是一種內源性免疫抑制因子，由Th細胞分泌產生，能夠抑制多種細胞合成其他細胞因子，抑制SAP患者胰腺組織中的IL-10的表達量可減輕炎癥反應，對胰臟具有保護作用。SAP患者隨著病情的減輕，致炎-抗炎因子出現平衡，炎癥反應減輕，IL-10水平降低〔10〕。MCP-1是主要的單核/巨噬細胞趨化因子，能夠調節單核/巨噬細胞分泌量，誘發炎癥反應，參與疾病的演進過程。研究表明，MCP-1水平與細胞的損傷程度、局部并發癥、病理損害評分、疾病的嚴重程度等呈正相關〔11〕。本實驗表明炎癥反應和炎癥因子在SAP的發生、發展中起著重要作用。清胰Ⅱ號可以降低炎癥因子的水平，從而降低炎癥反應，延緩SAP進程。

腸道是全身的炎癥反應的原動力，能夠合成諸多炎癥介質，SAP發生時患者出現胰腺壞死和胰外器官衰竭，阻礙腸道屏障功能，加劇炎癥反應〔12，13〕。外周血中DAO活性能反映腸上皮細胞成熟度及完整性，可作為腸黏膜屏障功能監控的主要指標〔14，15〕。AMY是臨床診斷中用于檢測SAP的常用指標，AMY含量的高低與胰腺炎的發生有密切關系〔16〕。臨床上通過檢測血清中AMY的活性能夠評價SAP的病情變化〔17，18〕。本研究結果表明，清胰Ⅱ號可以減輕腸黏膜損傷，進而緩解SAP大鼠的嚴重程度。

細胞凋亡是一種程序性死亡方式，可減輕炎癥反應，被認為具有保護SAP的作用，對SAP病程的進展具有重要作用。研究表明，增加胰腺細胞的凋亡率，減少細胞的壞死率可阻礙胰腺損傷〔19〕。本實驗結果表明清胰Ⅱ號可增加胰腺細胞的凋亡率，保護胰腺損傷，緩解SAP進程。

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〔2017-09-25修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

R69

A

1005-9202(2017)21-5233-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.007

貴州省科技廳聯合基金項目(黔科合LH字〔2016〕7480號LH120170211)；貴州省科技廳中醫藥現代化攻關項目(黔科合中藥專字〔2003〕13 號)

1 遵義醫學院附屬醫院胃腸外科

2 遵義醫學院附屬醫院貴州省細胞工程重點實驗室

3 遵義醫學院附屬醫院肝膽外科

兌丹華(1957-)，女，教授，主任醫師，主要從事胰腺疾病基礎與臨床應用研究。

尚獻會(1980-)，男，碩士，主治醫師，主要從事胰腺疾病基礎研究。