穴位埋線對血管性癡呆大鼠海馬CA1區p53蛋白表達的影響

李 霞 唐中生 吳春朋 謝高宇 陸 瑩 羅亞非

(貴陽護理職業學院基礎護理教研室,貴州 貴陽 550081)

穴位埋線對血管性癡呆大鼠海馬CA1區p53蛋白表達的影響

李 霞 唐中生1吳春朋1謝高宇1陸 瑩1羅亞非1

(貴陽護理職業學院基礎護理教研室,貴州 貴陽 550081)

目的觀察穴位埋線對血管性癡呆(VD)大鼠海馬CA1區p53蛋白表達的影響。方法取SD大鼠隨機分成假手術組、VD模型組、穴位埋線組、尼莫地平組，采用改良的Pulsinelli四血管閉塞法(4-VO)建立VD大鼠模型，兩個治療組分別施行穴位埋線和尼莫地平治療，連續15 d。水迷宮行為學測試后，斷頭處死大鼠，采集海馬CA1區，用免疫組織化學法檢測其p53表達，并取大腦皮質做冠狀位病理切片進行HE染色，觀察并比較各組大鼠海馬CA1區p53和大腦皮質神經元損傷程度。結果假手術組海馬CA1區未見p53陽性細胞，穴位埋線組及尼莫地平組海馬CA1區p53陽性細胞平均灰度值均明顯高于VD模型組(Plt;0.05)，大腦皮質神經元的損傷和變性減輕且數量增加。結論穴位埋線可明顯降低海馬CA1區p53蛋白的表達，抑制VD大鼠腦損傷引起的細胞凋亡，對腦組織起保護作用，這可能是其治療VD的作用機制之一。

穴位埋線；血管性癡呆；p53；海馬

血管性癡呆(VD)是指各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產生的獲得性智能損害綜合征，為一慢性進行性疾病〔1〕。 針灸治療VD療效肯定，副作用少，可明顯減輕癡呆癥狀、改善學習和記憶〔2,3〕。作為針灸療法的分支，穴位埋線療法已經廣泛應用于臨床各科〔4〕。研究表明〔5〕，穴位埋線可改善VD大鼠學習記憶能力。在此基礎上，我們制備VD大鼠模型，采用穴位埋線治療，探討VD發病與海馬CA1區p53蛋白表達的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠70只，體重280～300 g，清潔級，由重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.2實驗器材 可吸收性外科縫線(經絡疏通專用線，中國中醫研究院眾益科技開發公司)；華佗牌1.5寸毫針(蘇州醫療器械廠)；電子天平(巨天儀器設備有限公司，ES200)；微型動脈夾(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)；SDQ-30雙極射頻電凝器(蘇州手術器械廠)。

1.3藥品與試劑 10%水合氯醛(天津市永大化學試劑有限公司)；尼莫地平片(正大青春寶藥業有限公司，批號：0801002)；4%多聚甲醛、p53免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4VD大鼠模型的建立 采用改良Pulsinelli四血管阻斷法(4-VO)建立VD大鼠模型〔6〕。按隨機數字表法將已經制備成功的VD模型大鼠分為VD模型組、穴位埋線組和尼莫地平組，除去治療過程中死亡的大鼠，保證每組至少10只。另設假手術組10只作對照，處理步驟同上，但不進行椎動脈燒灼和頸總動脈夾閉。四個組的治療時間和治療方法按課題組之前的方法進行〔5〕。

1.5標本制作及檢測 用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，迅速開胸暴露心；經升主動脈插管后，先用100 ml生理鹽水快速沖洗，隨后用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.4)灌流約1 h；灌注完畢后迅速開顱取出完整大腦,剝離腦膜,用鑷子從矢狀縫將皮質向兩邊分,先取海馬放入4%多聚甲醛固定，依次酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。連續冠狀切片，片厚5 μm，進行p53免疫組織化學染色〔二氨基聯苯胺(DAB)染色〕。后取額葉部大腦皮質，連續冠狀切片，片厚5 μm，進行HE染色。

1.6p53蛋白圖像分析 p53陽性細胞主要表達于細胞核，著色呈棕黃色。運用圖像分析系統測定各組海馬CA1區p53蛋白陽性反應物的平均灰度值(平均灰度值0～255，其值越大，表達水平越低)。

1.7統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行ANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結 果

2.1各組大腦皮質神經元病理學觀察 假手術組大腦皮質神經細胞排列緊密，細胞邊緣清晰，未見神經元變性和壞死，胞質染色均勻，核圓而大，核仁、核膜清晰，有輕微水腫和神經元腫脹，無膠質細胞增生和淋巴細胞浸潤。VD模型組大腦皮質局部出現水腫，神經元中度腫脹、變性和壞死，體積增大，細胞稀疏，細胞質染色變淺及尼氏體消失，細胞核體積增大，染色變淺，膠質細胞增生形成結節，無淋巴細胞浸潤。穴位埋線組大腦皮質見輕微組織水腫和神經元腫脹，神經元無變性和壞死，無膠質細胞增生和淋巴細胞浸潤。尼莫地平組大腦皮質水腫明顯減輕，神經元輕微腫脹，神經元輕度變性和壞死，核固縮現象減輕，膠質細胞輕度增生。見圖1。

2.2各組海馬CA1區神經元p53表達 見圖2。假手術組未

圖1 各組大腦皮質冠狀切片(HE，×400)

圖2 各組海馬CA1區p53陽性表達(DAB，×400)

見p53陽性細胞，其平均灰度值(191.39±5.13)，是其背景的非特異性反應；其余各組均可見p53陽性細胞，鏡下免疫反應產物呈棕黃色，主要表達于細胞核，少量表達于胞質。VD模型組平均灰度值(144．28±10．33)，穴位埋線組(186.21±2.25)，尼莫地平組(177.12±2.06)。VD模型組平均灰度值明顯低于假手術組(Plt;0.01)；與VD模型組平均灰度值比較，穴位埋線組明顯增設 (Plt;0.05)，穴位埋線組平均灰度值與尼莫地平組無明顯差異(Pgt;0.05)。

3 討 論

研究認為海馬CA1區神經細胞凋亡可能是VD重要的發病機制和病理基礎〔7〕。p53是一種促凋亡基因，在正常組織中的表達極低，p53及其相關基因在腦缺血中的表達與調控，是神經元凋亡的關鍵環節。研究表明，腦損傷可導致p53的表達增加〔8〕，抑制p53的表達對腦缺血組織具有保護作用〔9〕。p53還能減少Bcl-2蛋白的表達，增強Bax蛋白表達，并調節Bax、caspase等系列下游基因而促進神經細胞凋亡〔10〕，表明p53基因具有促進神經細胞凋亡的作用。有研究發現，p53蛋白表達增加參與了大鼠腦創傷后神經細胞的DNA斷裂〔11〕，在腦創傷后的大鼠海馬區凋亡的神經細胞中檢測到p53 mRNA〔12〕。Martin等〔13〕也認為大鼠腦創傷后p53蛋白表達增加，可能通過調整Bax蛋白表達促進神經細胞凋亡。本文結果提示穴位埋線治療后大鼠p53蛋白表達明顯下降。穴位埋線是在中醫理論指導下，將可吸收性外科縫線置入穴位內，利用線對穴位產生的持續性刺激作用以防治疾病的方法〔14〕。中醫認為，氣行則血行，血行則髓生，氣血調和，百病不生。癡呆患者多屬本虛標實，氣滯血瘀。取百會、膈俞、氣海、三陰交(雙)、膻中組成益氣活血方，探索穴位埋線對缺血性腦血管病的作用機制，五穴組合，共奏益氣活血之功。關建軍等〔15〕研究表明，針灸益氣活血法可明顯改善VD大鼠學習記憶能力，降低海馬真性膽堿酯酶(T-chE)含量，可顯著提高VD大鼠大腦皮質CA1區的突觸數密度和突觸活性區的面積密度〔16〕，還可提高VD大鼠海馬組織中SOD活性及降低MDA含量〔17〕。本文結果提示穴位埋線通過下調VD大鼠海馬CA1區p53蛋白的表達，抑制了VD大鼠腦損傷引起的細胞凋亡，對VD大鼠腦組織起到了保護作用，這可能是其治療VD的作用機制之一。

1Wahlund LET，Gauthier S.Vascular cognitive impairment in clinical practice〔M〕.Cambridge,UK：Cambridge University Press,2009:301-10.

2張 俊，王天錫.針灸治療血管性癡呆的實驗研究及臨床進展〔J〕.內蒙古中醫藥，2014;4(1)：122-3.

3羅梅桂，羅本華.針灸治療血管性癡呆的機理研究進展〔J〕.廣西中醫藥大學學報，2014;17(4)：97-9.

4蒙 珊,呂計寶,文小江.穴位埋線療法臨床應用近況〔J〕.山西中醫,2012;28(2):56-8.

5唐中生，謝高宇，陸 瑩，等.穴位埋線對血管性癡呆大鼠學習記憶能力及血清白介素-1β、腫瘤壞死因子-α表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2014;34(22)：6407-9.

6李文東，姜洪波，連曉倩，等.Pulsinelli四血管法大鼠全腦缺血模型制作方法的改進〔J〕.新鄉醫學院學報，2010;27(3):237-9.

7Fang M,Li J,Tiu SC,etal.N-methyl-D-aspartate receptor and apoptosis in Alzheimer disease and multiinfarct dementia〔J〕.Neurosci Res,2005;81(2):269-74.

8Khocjbin S,Lawrece JJ.Processing of p53mRNA during induced differentiation of murine erythrolinkimia cells:is an altered splicing medianism responsible for the post transcriptional control of gene expression〔J〕.Gene,1998;72:177-85.

9Morrison RS,Kinoshita Y,Johnson MD,etal.p53-dependent cell death signaling in neurons〔J〕.Neurochem Res,2003;28(1):15.

10蘇 方，張 培，姜治偉，等.海馬神經元缺血/再灌注后自噬的表達及其作用〔J〕.中國應用生理學雜志，2011;27(2)：187-90.

11Lu J,Moochhala S,Kaur C,etal.Changes in apoptosis-related protein(p53，Bax，Bcl-2 and Fos)expression with DNA fragment in the central nervous system in rats after closed head injury〔J〕.Neurosci Lett,2000;290(2)：89-92.

12McCullers DL，Sullivan PG,Scheff SW,etal.Mifepristone protects CA1 hippocampal neurons following traumatic brain injury in rat〔J〕.Neuroscience,2002;109(2)：219-30.

13Martin LJ,Kaiser A,Yu JW,etal.Injury-induced apoptosis of neurons in adult brain is mediated by p53-dependent and p53-independent pathways and requires Bax〔J〕.Comp Neurol,2001;433(3)：299-311.

14中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會GB/T 21709.10-2008針灸技術操作規范 10部分穴位埋線〔S〕.北京：中國標準出版社，2008：1-7.

15關建軍，賈成文，朱健康，等.針灸益氣活血方對血管性癡呆大鼠海馬T-chE活性表達的實驗研究〔J〕.陜西中醫學院學報，2008;31(6):65-6.

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17姬軍風，關建軍，吳世衛.針灸益氣活血法對血管性癡呆大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛的影響〔J〕.河北中醫，2011;33(10):1554-6.

〔2016-09-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R743

A

1005-9202(2017)21-5236-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.008

貴州省教育廳自然科學研究項目(No.黔教科2010050)

1 貴陽中醫學院解剖學教研室

唐中生(1977-)，男，碩士，教授，主要從事腦血管病學研究。

李 霞(1978-)，女，講師，主要從事老年護理教育教學研究。