補陽還五湯聯合依達拉奉對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響

鐘芳芳 吳承龍 孫新芳 章燕幸

(紹興市人民醫院 浙江大學紹興醫院神經內科，浙江 紹興 312000)

補陽還五湯聯合依達拉奉對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響

鐘芳芳 吳承龍 孫新芳 章燕幸

(紹興市人民醫院 浙江大學紹興醫院神經內科，浙江 紹興 312000)

目的研究補陽還五湯聯合依達拉奉對小鼠腦缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡及Bcl-2、Bax和Caspase-3表達的影響。方法50 只小鼠隨機分假手術組，模型組，補陽還五湯(BYHWD)組，依達拉奉(ED)組，補陽還五湯+依達拉奉(BYHWD+ED)組，每組再隨機分成缺血再灌注后1、7 d組。首先制備小鼠大腦中動脈缺血模型，TUNEL法觀察神經細胞凋亡率，應用免疫組化方法觀察各組大腦皮質Bcl-2、Bax、Caspase-3表達陽性細胞數。結果與模型組比較，BYHWD組、ED組及BYHWD+ED組均能明顯降低腦組織凋亡指數(Plt;0.01)，升高Bcl-2陽性表達，降低Bax、Caspase-3陽性表達(Plt;0.01)，兩藥聯用變化趨勢更明顯。結論補陽還五湯與依達拉奉聯用能降低腦缺血再灌注損傷模型鼠腦組織細胞凋亡基因Bax、Caspase-3的表達，增加具有神經元保護作用的Bcl-2基因表達，從而抑制神經細胞凋亡，加速神經功能的恢復，協同發揮腦保護作用。

補陽還五湯；依達拉奉；腦缺血再灌注；細胞凋亡；Caspase-3；Bcl-2/Bax

缺血性腦血管病的發病是一個多環節、多反應的結果，減輕腦缺血半暗帶區的神經元凋亡則是治療的關鍵〔1〕。本研究采用有益氣活血通絡之功的補陽還五湯聯合抗氧自由基的神經保護劑依達拉奉作用于小鼠腦缺血再灌注損傷模型來探討兩藥聯用對腦缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡及Caspase-3、Bcl-2和Bax凋亡蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1主要藥品、試劑及儀器 依達拉奉注射液(南京先聲東元制藥有限公司)；補陽還五湯(紹興市人民醫院制劑室提供，由黃芪120 g，當歸6 g，川芎3 g，地龍3 g，赤芍5 g，紅花3 g和桃仁3 g組成，水煎、濃縮后生藥含量為2.0 g/ml)。氯化三苯基四氮唑(TTC,中國醫藥集團上海化學試劑公司)。TUNEL凋亡試劑盒(瑞士Roche公司，批號11684817910)；免疫組化染色試劑盒：Bcl-2(批號20070223)，Bax(批號20070223)，Caspase-3(批號20070227)，均購自武漢博士德生物工程有限公司。二氨基聯苯胺(DAB，購自北京中山試劑公司)。CM1850 冰凍切片機(德國Leica)；光學顯微鏡、光學顯微數碼成像系統(日本Olympus公司)。

1.2動物分組及給藥 選擇8月齡C57BL/6雄性小鼠50只，體重45～50 g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，合格證號：scxk(滬)2008-0016。實驗前先飼養觀察3 d，隨機分成假手術組(分離不插栓塞線)，模型組(缺血90 min)，補陽還五湯組(BYHWD組)，依達拉奉組(ED組)，補陽還五湯+依達拉奉組(BYHWD+ED組)，每組10 只。術后1、7 d每組隨機取5只。BYHWD組于術后2 h起首次灌服補陽還五湯藥液，按10 ml/kg給藥；ED組于術后2 h尾靜脈注射，按3 mg/kg給藥；BYHWD+ED組，于術后2 h分別予等劑量BYHWD灌胃和ED尾靜脈注射給藥；模型組和假手術組動物均給予等量生理鹽水灌胃及尾靜脈注射給藥；首次給藥以后1次/d，連續7 d。

1.3小鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型制作 參照改良的Longa-Zea線栓法〔1〕制作小鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。缺血90 min后，拔出線栓再灌注。假手術組僅分離右側頸總動脈并離斷右頸外動脈，不予栓塞。術后2 h根據神經功能評分驗證造模成功。觀察造模動物出現右側Horner征和左側以上肢為重的偏癱作為動物模型成功的判定標準，不符合標準的動物予以剔除，并隨機補充。小鼠在腦缺血再灌注1、7 d后經10%水合氯醛深度麻醉(600 mg/kg)，迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，于心尖部剪開左心室，插管至主動脈，快速注入150 ml甲醛灌注固定，斷頭取腦，沿視交叉后緣做冠狀切片，常規石蠟包埋，做5 μm連續切片用于凋亡與免疫組化檢測。

1.4TUNEL法檢測神經細胞凋亡 按照試劑盒說明書進行操作。①切片常規脫蠟至水，滴加蛋白酶K室溫消化20 min；②微波修復抗原5 min后自然冷卻；③滴加TUNEL反應液，37℃孵育1 h；④滴加辣根過氧化物酶標抗熒光素抗體工作液，37℃孵育30 min；⑤用DAB顯色劑呈色；⑥常規脫水、透明、封片。在光鏡下觀察，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞。計算凋亡指數(AI)，AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.5免疫組化檢測 切片常規脫蠟至水，滴加3%H2O2孵育10 min；微波修復抗原10 min自然冷卻至室溫；滴加10%正常山羊血清，室溫封閉30 min；分別滴加兔抗Bcl-2、兔抗Bax 及兔抗Caspase-3抗血清，4℃孵育24 h；滴加二抗工作液(山羊抗兔)室溫反應15 min；滴加辣根酶標記卵白素工作液，室溫反應15 min；DAB顯色劑呈色；梯度脫水、中型樹脂封片。在光鏡下觀察，細胞質有棕黃色顆粒者為陽性細胞。計算陽性染色神經細胞數目。在光鏡下，每只小鼠各取兩張切片，在梗死灶周邊區隨機選擇5個視野，分別分析Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性細胞百分數及神經細胞AI，取平均值。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗，單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組神經細胞AI比較 腦缺血再灌注1、7 d后，模型組和各用藥組神經細胞AI均較假手術組明顯升高(Plt;0.01)；且與缺血再灌注1 d相比，7 d時模型組和各用藥組神經細胞AI明顯降低(Plt;0.01)。與同時段模型組比較，各用藥組神經細胞AI顯著降低(Plt;0.05)；其中以BYHWD+ED組降低趨勢最明顯，但ED組和BYHWD組無顯著差異(Pgt;0.05)，見表1。

表1 各組神經細胞AI比較

與假手術組比較：1)Plt;0.01；與模型組比較：2)Plt;0.01；與ED或BYHWD組比較：3)Plt;0.05；與同組內1 d比較：4)Plt;0.01，下表同

2.2各組Bcl-2、Bax表達及Bcl-2/Bax比較 腦缺血再灌注后，模型組腦組織Bcl-2、Bax表達較假手術組明顯升高(Plt;0.01)。與缺血再灌注1 d相比，7 d時模型組和各用藥組腦組織Bcl-2、Bax基因表達明顯減少(Plt;0.01)。在同一時間點各用藥組與模型組比較：腦組織Bcl-2基因表達均明顯增加(Plt;0.01)，而Bax基因表達有下降，以7 d時明顯(Plt;0.05)；且BYHWD+ED組改變趨勢最明顯(Plt;0.05)，BYHWD組和ED組之間則無顯著差異(Pgt;0.05)。同一時間點，各用藥組較模型組Bcl-2/Bax有所增高，其中以BYHWD+ED組比值增高最明顯(Plt;0.05)。見表2。

表2 各組Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比較

2.3各組Caspase-3表達比較 腦缺血再灌注后，模型組及各用藥組神經細胞Caspase-3表達較假手術組明顯增高(Plt;0.01)。與缺血再灌注1 d相比，7 d時模型組與各用藥組神經細胞Caspase-3陽性細胞數顯著降低(Plt;0.01)。與模型組同時間點比較，各用藥組神經細胞Caspase-3陽性細胞數顯著降低(Plt;0.05)，以BYHWD+ED組為著(Plt;0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后神經元Caspase-3的表達

3 討 論

腦缺血再灌注后神經細胞損傷主要包括壞死和凋亡。缺血中心區細胞迅速壞死，而周邊缺血半暗帶區，則發生以凋亡為主的遲發性死亡〔2〕。因此，搶救半暗帶區神經細胞，減少細胞凋亡發生能減輕腦缺血再灌注損傷的程度和范圍〔3〕。但細胞凋亡的發生受復雜的多基因、多系統調控。線粒體凋亡主要通過Bcl-2家族蛋白調節，而Bcl-2和Bax是Bcl-2家族參與細胞凋亡調控最具代表性的基因〔4〕。前者抑制細胞凋亡，后者促進細胞凋亡，Bcl-2與Bax蛋白可相互結合形成結合體，過度表達Bax蛋白可促進細胞凋亡并抑制Bcl-2的抗凋亡作用。Bcl-2/Bax的比值變化則決定細胞的凋亡與生存，比值越高，細胞存活率越高；比值越低，細胞凋亡率越高〔5，6〕。此外，Caspase-3是細胞凋亡的敏感指標，被認為是細胞凋亡蛋白酶級聯反應最關鍵的執行者，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用〔7〕，阻抑Caspase-3表達對阻止腦損傷的進一步惡化和改善神經功能具有重要意義。補陽還五湯具有益氣活血通絡之功，通過多環節、多靶點發揮神經保護作用〔8，9〕。依達拉奉具有清除自由基和抑制脂質過氧化的作用，可抑制神經、血管內皮細胞的過氧化及遲發性死亡，減輕腦水腫及組織損傷，并可促進神經營養因子的產生〔10，11〕。本研究提示腦缺血再灌注損傷可引起神經細胞凋亡發生，隨時間延長細胞凋亡呈減輕趨勢；BYHWD和ED對神經細胞的凋亡具有抑制作用，以兩者聯用的效果尤為顯著。本實驗表明BYHWD和ED可通過促進重要的凋亡抑制基因Bcl-2的表達，抑制凋亡誘導基因Bax及Caspase-3的表達，從而抑制神經細胞凋亡，加速神經功能的恢復，協同發揮腦保護作用。

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8龍建飛，張秋霞，王 蕾，等.補陽還五湯治療缺血性中風藥理作用機制的研究進展〔J〕.世界中醫藥，2015；10(5)：805-7.

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〔2016-10-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R34

A

1005-9202(2017)21-5251-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.015

紹興市公益性技術應用研究計劃項目(No.2013B70076)

鐘芳芳(1977-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事腦血管病研究。