參葉緩癡膠囊對SHSY5Y細胞凋亡的作用

張明天 張永和 張蓮珠

(長春中醫藥大學附屬醫院中醫藥研究中心，吉林 長春 130021)

參葉緩癡膠囊對SHSY5Y細胞凋亡的作用

張明天 張永和 張蓮珠

(長春中醫藥大學附屬醫院中醫藥研究中心，吉林 長春 130021)

目的探討參葉緩癡膠囊(SYHC)改善認知功能障礙(CI)作用的相關機制。方法MTT法觀察SYHC對細胞增殖的影響，不同濃度岡田酸誘導下細胞的存活率及岡田酸IC50的確定。流式細胞技術檢測細胞凋亡及SYHC對岡田酸致神經細胞凋亡后的保護作用。酶聯免疫吸附(ELISA)法測定細胞中相關神經介質的含量及酶的活性。結果結論SYHC對神經元細胞具有促增殖作用，能夠保護神經細胞，降低岡田酸對其造成的損傷，并對已受損的神經細胞具有一定的修復作用。其作用途徑可能是從維持細胞膽堿能水平、避免細胞tau蛋白過度磷酸化及調控細胞凋亡相關基因表達等方面來實現的。

參葉緩癡膠囊；認知功能障礙；岡田酸；tau 蛋白

認知功能障礙(CI)主要包括感知覺障礙、思維障礙、注意障礙、記憶障礙、智能障礙等。重者達到癡呆的程度，輕者則表現為CI，其中輕者具有早期干預的價值。CI是介于正常老化和老年癡呆(AD)之間的一種臨床狀態，CI代表AD的早期階段，由于CI在臨床上處于可逆期，如果在CI階段能給予治療及干預可大大降低AD發病率。參葉緩癡膠囊(SYHC)由淫羊藿、人參、銀杏葉等組成，臨床治療CI療效顯著。乙酰膽堿(Ach)是一種重要的神經遞質。其主要功能是能夠促進激活腦神經傳導功能，提高信息傳遞速度，增強大腦記憶能力，全面改善腦功能并能延緩衰老。tau蛋白是一種低分子量的微管相關蛋白，當tau蛋白發生高度磷酸化時則失去對微管的穩定作用，導致神經纖維退化，從而引起神經功能失調及神經細胞凋亡。本文以岡田酸損傷神經細胞作為模型，初步探究該藥改善CI的作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞株 SH-SY5Y人神經母細胞瘤細胞來源于中國科學院細胞庫。

1.2試劑 SYHC(長春中醫藥大學附屬醫院 制劑中心)，低糖DMEM培養基、胰酶(Gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DMSO、岡田酸(SIGMA公司)，細胞凋亡檢測試劑盒(BD公司)，ACH、chAT、AchE、Bax、Bcl-2、BDNF、NGF及p-tau試劑盒(RD公司)。

1.3儀器 BD FACS Calibur流式細胞儀(美國 BD)，INFINITE M200酶標儀(瑞士TECAN)，IX71倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)，Mili Q超純水器(美國Millipore)，3111二氧化碳培養箱(美國 THERMO)，SW-CJ-1F 超凈臺(上海博迅實業有限公司)等。

1.4細胞培養 SH-SY5Y人神經母細胞瘤細胞培養于10% FBS的DMEM低糖培養基中，37℃，飽和濕度，5% CO2溫箱培養。每周更換3次培養基，0.125%胰蛋白酶消化細胞，輕輕吹打形成細胞懸液進行傳代培養。

1.5統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1SYHC對SH-SY5Y細胞存活率的影響 參葉緩癡膠囊與SH-SY5Y神經細胞共孵育24 h，在 6.25～100 μg/ml濃度范圍內具有細胞增殖作用。對照組細胞存活率為(100.1±4.33)%，隨著濃度的增加，其增殖效果逐漸加強，其中6.25 μg/ml細胞存活率(100.4±1.16)%，12.5 μg/ml細胞存活率(100.8±4.35)%，25 μg/ml細胞存活率(105.7±4.35)%，50 μg/ml細胞存活率(113.7±2.41)%，100 μg/ml細胞存活率(119.3±3.40)%。但濃度高于100 μg/ml時，SYHC對神經細胞的促增殖作用逐漸減緩，200 μg/ml時，細胞存活率為(110.7±2.15)%。

2.2岡田酸致細胞損傷IC50的測定 岡田酸可誘導SH-SY5Y細胞凋亡，具有顯著殺傷作用，其殺傷效力具有濃度依賴性，且作用效果與時間具有正相關性，岡田酸320 nmol/L作用48 h，細胞存活率為19.7%，通過擬合曲線，計算其IC50為80 nmol/L，見表1。通過顯微鏡察不同濃度岡田酸誘導SH-SY5Y細胞48 h后，細胞形態發生顯著變化。對照組(A)細胞呈三角形或多角形，軸突清晰，胞膜完整光滑，隨著岡田酸濃度的增加(B～F)，細胞逐漸皺縮，胞質及胞核濃縮，細胞間接觸消失。見圖1。

表1 岡田酸對SH-SY5Y人神經母細胞瘤細胞存活率的影響

與0 nmol/L比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01，3)Plt;0.001

A.對照組;B～F：岡田酸濃度分別為20、 40、 80、 160、 320 nmol/L圖1 與岡田酸共孵育48 h 后SH-SY5Y細胞形態(×100)

2.3SYHC對SH-SY5Y細胞的保護與修復 當細胞在與SYHC共同孵育12 h后，加入損傷因子岡田酸(80 nmol/L)，繼續培養48 h，SYHC對SH-SY5Y細胞具有明顯的保護作用。其中對照組細胞存活率(100.0±16.0)%，模型組細胞存活率(54.6±8.7)%，12.5 μg/ml細胞存活率(56.6±5.1)%,25 μg/ml細胞存活率(64.4±5.3)%,50 μg/ml細胞存活率(69.8±2.5)%,100 μg/ml細胞存活率(83.3±4.2)%。

經過損傷因子岡田酸(80 nmol/L)損傷后的SH-SY5Y細胞，在SYHC 12.5～100 μg/ml的濃度下，對其具有一定的修復作用。其中對照組細胞存活率(100.0±1.3)%，模型組細胞存活率(48.4±2.0)%，12.5 μg/ml細胞存活率(49.0±0.7)%,25 μg/ml細胞存活率(51.8±0.8)%,50 μg/ml細胞存活率(61.2±3.2)%,100 μg/ml細胞存活率(62.5±6.6)%。

2.4流式細胞儀檢測岡田酸致SH-SY5Y細胞的凋亡情況 與對照組(0.02%±6.44%)比較，岡田酸20、40、80、160、320 nmol/L組細胞凋亡率(5.13%±0.68%、23.72%±1.06%、51.38%±1.78%、65.99%±0.94%、82.28%±0.70%)逐漸增加，表明岡田酸可以造成細胞凋亡。在岡田酸濃度為80 nmol/L時，細胞凋亡率為51.38%，確定此濃度為后續實驗中神經元細胞損傷濃度。

2.5流式細胞儀檢測參葉緩癡膠囊對SH-SY5Y細胞凋亡的保護情況 與模型組(45.40%±8.76%)比較，參葉緩癡膠囊25、50、100 μg/ml組細胞凋亡率(35.61%±5.39%、30.18%±2.56%、16.62%±4.26%)降低(Plt;0.05)，表明參葉緩癡膠囊對岡田酸致SH-SY5Y細胞凋亡具有保護作用。另外，對照組為0.03%±16.09%，12.5 ng/ml組為43.40%±5.12%。

2.6參葉緩癡膠囊對岡田酸誘導SH-SY5Y細胞膽堿能異常的影響 與對照組比較，岡田酸致SH-SY5Y細胞損傷模型組細胞Ach含量明顯降低(Plt;0.001)，ChAT含量減少(Plt;0.001)，AchE酶活力明顯升高(Plt;0.001)。與模型組比較，參葉緩癡膠囊50、100 μg/ml給藥組SH-SY5Y細胞Ach含量增加(Plt;0.001)，25、50、100 μg/ml給藥組SH-SY5Y細胞ChAT含量增加(Plt;0.05，Plt;0.01)，AchE活力降低(Plt;0.01)。見表2。

2.7參葉緩癡膠囊對岡田酸誘導SH-SY5Y細胞凋亡基因的影響 與對照組比較，岡田酸模型組Bax蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯減少(Plt;0.001)。與模型組比較，參葉緩癡膠囊50、100 μg/ml組細胞Bax蛋白表達量降低，Bcl-2蛋白表達量增加(Plt;0.05)，Bax/Bcl-2比值降低。見表3。

2.8參葉緩癡膠囊對岡田酸誘導SH-SY5Y細胞磷酸化tau蛋白含量的影響 岡田酸造成SH-SY5Y細胞損傷時，細胞液中p-tau的含量明顯增加(Plt;0.001)。與模型組〔(3.08±0.07)pg/ml〕比較，參葉緩癡膠囊50、100 μg/ml給藥組〔(2.78±0.12)pg/ml、(2.68±0.07)pg/ml〕細胞液中p-tau含量明顯下降(Plt;0.05，lt;0.01)。對照組為(2.54±0.02)pg/ml，12.5 μg/ml組為(3.06±0.16)pg/ml，25 μg/ml組為(2.95±0.11)pg/ml。

表2 參葉緩癡膠囊增加岡田酸損傷SH-SY5Y細胞Ach、ChAT含量，抑制AchE活性

與模型組比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01，3)Plt;0.001

表3 參葉緩癡膠囊對岡田酸誘導SH-SY5Y細胞Bax/Bcl-2表達變化的比較

3 討 論

CI多發病于老年人，是老年癡呆的前兆，老年人的記憶功能隨著年齡的增長而逐漸衰退，記憶和認知功能減退是正常老化不可避免的現象〔1，2〕，而虛、瘀、濁、毒〔3〕是多種老年病的主要中醫病理基礎，也是大多數老年病的基本病機，虛為其本，瘀、濁、毒為其標，血瘀、痰濁、毒邪既是臟氣虛衰的結果，又是主要的致病因素，四者相互影響，成為認知功能障礙及癡呆的復雜發病機理〔4～6〕。參葉緩癡膠囊以淫羊藿溫補腎陽，補先天之本(腎)，以人參健脾益氣，補后天之本(脾)，以銀杏葉活血化瘀，通調血脈(心)。岡田酸是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，在一定濃度下可以抑制磷酸酯酶的活性，磷酸酯酶可以催化磷酸蛋白內的磷酸酯鍵水解，達到去磷酸化的目的〔7〕。本研究發現：(1)參葉緩癡膠囊對正常SH-SY5Y細胞在一定濃度范圍內具有促增殖作用且濃度與細胞數量呈現正相關性。在參葉緩癡膠囊對細胞的保護作用實驗中，模型組與中藥治療組比較，在50 μg/ml與100 μg/ml濃度下保護效果最為明顯，提示在進一步研究參葉緩癡膠囊對SH-SY5Y細胞的保護途徑時，要將作用濃度控制在100 μg/ml以下。同時參葉緩癡膠囊對SH-SY5Y細胞的保護作用強于修復作用。 (2)參葉緩癡膠囊可降低岡田酸致SH-SY5Y細胞損傷模型細胞凋亡率。(3)降低細胞凋亡基因Bax蛋白的表達含量可提高抑凋亡基因(Bcl2)蛋白表達量，Bax/Bcl-2比值降低。本研究提示結果表明，參葉緩癡膠囊可能通過抑制細胞凋亡的途徑對腦細胞損傷起保護作用。(4)岡田酸可以造成神經元細胞乙酰膽堿水平下降、tau蛋白過度磷酸化、細胞凋亡基因表達異常以及神經營養因子缺失。(5)參葉緩癡膠囊改善認知功能障礙可能與其調節中樞膽堿能神經功能，促進細胞ACh合成并抑制分解有關。(6)腦內微管蛋白tau蛋白是一種分布在中樞神經系統內的低分子量含磷糖蛋白，本研究表明，參葉緩癡膠囊改善學習記憶障礙的作用可能與抵制P-tau生成有關?？傊琒YHC改善CI其作用途徑可能與維持細胞膽堿能水平、避免細胞tau蛋白過度磷酸化及調控細胞凋亡相關基因表達等方面有關。

1Fillit H，Evansd，Butler R，etal.Achieving and maintaining cognitive veitality with wing〔J〕.Mayo Clin Proc，2002;77(7)：681-967.

2Chertkow H，Bergman H，Schipper HM，etal.Assessment of suspected dementia〔J〕.Can J Neurol Sci,2001;28(suppll)：S28-S41.

3李 浩，姚明江.淺談中醫“虛”、“瘀”、“濁”、“毒”與輕度認知障礙發病的關系〔J〕.中國中醫藥信息雜志，2006；3(11) ：4-5.

4王江山，周文泉.治療老年性癡呆臨床經驗〔J〕.中醫研究，2000;13(4)：18-9.

5趙 冰，張華東，張 晨，等.謝海洲治療老年性癡呆經驗〔J〕.中醫雜志，2006;47(4)：258-9.

6顧 蔚，侯曉薇，劉 鑫，等.對經基苯甲酸丙醋對果蠅壽命及超氧化物歧化酶、丙二酸的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(20)：2968-70.

7Fernandez JJ，Candenas ML，Souto ML，etal.Okadaic acid，useful tool for studying cellular processes〔J〕.Curr Med Chem，2002;9(2)：229-62.

〔2017-09-11修回〕

(編輯 郭 菁)

R285.5

A

1005-9202(2017)21-5255-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.017

吉林省自然科學基金項目(201215161)

張永和(1955-)，男，教授，博士生導師，主要從事中藥藥理學及中西醫結合基礎研究。

張明天(1988-)，男，碩士，主要從事分子生物學及流式細胞儀臨床檢驗及科研工作。